Aumento de la Tetra mexicano Astyanax mexicanus para análisis de fenotipos Post-larval y Immunohistochemistry Whole-mount
Summary
En este protocolo, demostrar cómo criar a adultos Astyanax mexicanus , criar las larvas y realizar montaje conjunto immunohistochemistry en post-larvaria pescado a los fenotipos de superficie y morfotipos de la cueva.
Abstract
Río y cueva adaptada a las poblaciones de Astyanax mexicanus muestran diferencias en morfología, fisiología y comportamiento. Investigación se centró en comparar formas adultas ha revelado las bases genéticas de algunas de estas diferencias. Poco se sabe sobre cómo las poblaciones difieren en las formas larvales (en el inicio de la alimentación). Este tipo de estudios puede proporcionar la penetración en cómo cavefish sobrevive hasta la edad adulta en su ambiente natural. Métodos para comparar el desarrollo post-larvario en el laboratorio requieren acuicultura estandarizada y regímenes de alimentación. Aquí describimos cómo criar peces una dieta a base de rotíferos de ricos en nutrientes en el agua sin recirculación para hasta post fertilización de dos semanas. Demostramos cómo recoger peces post-larvaria de este sistema de vivero y realizar montaje conjunto immunostaining. Inmunotinción es una alternativa atractiva para el análisis de la expresión del transgen para la investigación desarrollo y funciones de los genes en a. mexicanus. El método de vivero también puede utilizarse como un protocolo estándar para establecer poblaciones de densidad comparable de crecimiento en adultos.
Introduction
El tetra mexicano, Astyanax mexicanus, es una sola especie de peces que existen como poblaciones ribereñas (superficie peces) y un número de poblaciones cavernícolas (cavefish) nombrada de las cuevas que habitan (es decir, Tinaja, Molino, Pachón). Un número creciente de investigadores está usando a. mexicanus a investigar las bases genéticas y del desarrollo del comportamiento1,2,3,4, metabólicos5,6 ,7,8y evolución morfológica9,10,11. Recursos disponibles para los estudios de a. mexicanus incluyen un genoma secuenciado y anotado12; transcriptoma13; desarrollo provisional tabla14; y métodos de cría15,16,17, crear transgénicos18edición genes19. Difusión de herramientas adicionales y protocolos actualizados acelerará el crecimiento de la comunidad de investigación cavefish (ver esta colección de métodos20).
Nuestro objetivo es agregar al repertorio existente de herramientas proporciona un método robusto para evaluar el gen actividad en situ en post-larvaria a. mexicanus, de una manera comparable entre laboratorios. Hay dos desafíos para alcanzar esta meta. En primer lugar, hay una necesidad de regímenes estandarizados para incubar y criar los peces entre los laboratorios, como las diferencias en parámetros tales como la alimentación y la densidad afectan el crecimiento y maduración, de tal modo que afectan la actividad de los genes. En segundo lugar, hay una necesidad de un método estandarizado pero adaptable para examinar patrones de actividad de los genes en los peces las larvas. Abordamos estas cuestiones aquí, establecer las prácticas habituales de crianza peces post larvales y la introducción de un protocolo robusto montaje conjunto de inmunohistoquímica (IHQ) para la evaluación de expresión génica en a. mexicanus.
Primero demostramos cómo criar los peces a través de desove natural e identificar los huevos fertilizados. Siguiente describe es cómo incubar huevos fertilizados (larvas) y transferirlos a contenedores de vivero, donde se mantienen a una densidad de 20 peces por contenedor por dos semanas sin recirculación ni cambiar el agua. En la fertilización post de 5 días, los peces han desarrollado poste-larval etapas (que ya no tiene un suministro de yema de huevo) y se proporcionan alimentados con algas Brachionus plicatilis (rotíferos) como fuente de alimento rico en nutrientes que no requieren reposición diaria. Este método proporciona parámetros de crecimiento constante para el desarrollo de larvario y post larvario.
Para evaluar la función del gene, demostramos cómo quitar el pescado de los envases del vivero y realizar montaje en conjunto IHC. El método IHC se ha adaptado de protocolos desarrollados para su uso con Danio rerio21 y es eficaz para el examen de antígenos en los tejidos de a. mexicanus probados, incluyendo el cerebro, el intestino y el páncreas. IHC es una alternativa más rápida a la generación de animales transgénicos para el examen de expresión génica y la localización de la proteína. Este Protocolo será útil para estudios destinados a cultivo de a. mexicanus y la comparación de los fenotipos de los peces superficiales y cavefish en etapas poste-larvales.
Protocol
Representative Results
Discussion
Comparando la actividad de los genes entre superficie y cueva a. mexicanus requiere cuidadosamente controlados parámetros ambientales y los métodos que pueden ser replicados a través de laboratorios. Nuestro protocolo para elevar a. mexicanus proporciona contenido nutricional constante durante el desarrollo de las larva. Siguiendo este régimen de alimentación, funciones de los genes pueden compararse con confianza entre las poblaciones mediante el protocolo de inmunohistoquímica robustos que presentamos. Aquí discutimos la importancia de este método así como sus limitaciones y futuras aplicaciones de.
Para lograr el crecimiento de densidad comparable, se encontró que peces post-larvaria pueden ser levantado sin recirculación de agua para dos semanas en envases de 1,5 L en una dieta de rotíferos. Este protocolo también puede utilizarse para criar peces en un sistema de recirculación; sin embargo, deben añadirse diariamente rotíferos para compensar los perdidos a través de la salida del tanque. Nauplios de Artemia recién eclosionadas se utilizan como fuente de alimento en la acuicultura, pero se encontró que el uso de rotíferos tiene considerables ventajas, entre ellas: reducción de precio, mejor bioseguridad, nutrición constante y mejor calidad del agua (véase abajo).
En primer lugar, el costo semanal en consumibles es de 4 dólares para rotíferos, comparados con 14 dólares para Artemia. Sobre bioseguridad, rotíferos son criados en el laboratorio bajo condiciones controladas, mientras que la Artemia se recogen de la naturaleza y sujetos a variación natural microbiana o patógeno contenido23. Además, la composición en nutrientes de nauplios de Artemia son ambientalmente determinado y por lo tanto incompatibles. Nauplios de prosperan en sus propios almacenes de la energía después de la eclosión; rápidamente pierden valor nutritivo como se desarrollan y óptimo debe ser alimentados a los peces dentro de varias horas. Artemia comenzar alimentación en casa 12 post eclosión, que representa la primera vez que podría enriquecer nutricionalmente; sin embargo, en esta etapa se han convertido en demasiado grande para 5 peces de PD consumir. En comparación, rotíferos continuamente se alimentan de microalgas marinas, dando por resultado alto contenido nutriente independientemente de cuando se cosechan los rotíferos. Rotíferos son mucho más pequeños que Artmeia nauplios (160 vs 400 micrones), lo que facilita para los peces a capturar y tragar. Cavefish y pescado superficial post larva consume rotíferos en cantidades similares, no sugiriendo ninguna diferencia en la preferencia o la capacidad de capturar los rotíferos10.
Por último, nauplios de Artemia comienzan morir en agua varias horas después de ser introducido. Sin comer nauplios decaerá rápidamente disminuyendo la calidad del agua si no son retiradas manualmente. Quitar muerto Artemia es lento y peligroso para post larvas peces que no son mucho más grandes que la Artemia y pueden accidentalmente eliminar o heridos. Rotíferos pueden vivir indefinidamente en los contenedores de vivero y proporcionar alimento a los peces todo el tiempo sin afectar significativamente la calidad del agua.
Mientras que utilizando rotíferos como una fuente de alimentación tiene ventajas considerables, para mantener las algas comunes, rotíferos debe agregarse al sistema de cultura diariamente. Esto puede lograrse con un alimentador automático que dispensa las algas líquidas en el recipiente de cultivo de rotíferos (véase Tabla de materiales). Rotíferos deben también ser cosechados de esta configuración cada 24-48 horas para mantener la salud de la cultura. Los investigadores que crían peces muy poca frecuencia (una vez al año, por ejemplo) y no se ocupan de hacer comparaciones entre las poblaciones en las etapas poste-larvales pueden preferir Artemia como fuente de alimento, ya que los embriones enquistados pueden ser tramados en cualquier momento.
Se recomienda seguimiento el número de larvas nacidas y sobrevivientes para supervisar el éxito de eclosión y el crecimiento. Si la mayoría de los embriones o larvas muere, puede ser debido a la contaminación bacteriana o micótica. Se recomienda monitorear la calidad del agua del agua de pescado preparado y esterilizar cualquier equipo con etanol al 70%. Contenedores de vivero pueden reutilizarse después de limpiar y esterilizar. Para minimizar el riesgo de la enfermedad, también es importante retirar cualquier pez muerto de los envases del vivero y no añadir rotíferos antes PD 5, cuando los peces comienzan a comer.
A. mexicanus están sexualmente maduros en aproximadamente un año de edad. Esto es una limitación para la generación de transgénicos a. mexicanus en comparación con Danio rerio (pez cebra) que son capaces de criar a los 10-12 semanas24. Inmunohistoquímica (IHC) es un método alternativo para investigar la expresión de genes y la localización de la proteína. El protocolo descrito aquí puede ser adaptado a cada paso y utilizado para detectar antígenos en los tejidos de interés. Es importante tener en cuenta que algunos tejidos pueden ser más difíciles de visualizar en superficie peces debido a la pigmentación (una barrera que no existe en cavefish no pigmentado), que pueden influir en la interpretación de los estudios comparativos. Para abordar este problema potencial, pigmento de la superficie del pescado puede ser blanqueada después de la fijación usando peróxido de hidrógeno 3%.
IHC requiere fijación de tejido exitosa, bloqueo y penetración de anticuerpos. Métodos de cada una varían dependiendo del tejido y la proteína de interés. El tiempo de fijador y la fijación debe preservar arquitectura celular manteniendo el epitopo del antígeno. De este protocolo, utilizamos un fijador Cross-linking (paraformaldehído) y omitir un fijador de desnaturalización (tales como metanol o acetona). Encontramos que la incubación en acetona disminuido señal de anticuerpos para marcadores neuronales y pancreáticos. El paso de bloqueo es esencial para prevenir anticuerpos de unión a proteínas no objetivo en el tejido. Este método utiliza una combinación de suero normal (5%) y BSA (0,2%) en la solución de bloqueo. La solución de bloqueo contiene anticuerpos y proteínas que se unen a los sitios reactivos en proteínas en el tejido, disminuyendo la Unión inespecífica de los anticuerpos primarios y secundarios.
Para lograr penetración de anticuerpos, el tejido debe ser permeabilized. Esto puede lograrse con detergentes o solventes desnaturalización pero debe optimizarse para preservar el epitopo del antígeno. Nuestro protocolo utiliza una combinación de Tritón y el dimetil sulfóxido (DMSO). Tritón y DMSO se incluyen durante los pasos de incubación bloqueo y anticuerpo a concentraciones de 0.5% y 1%, respectivamente. Con esta concentración, hemos observado manchas en el cerebro, páncreas, intestino y músculo, lo que sugiere que es probablemente eficaz para la penetración de todos los tejidos. Tamaño de los peces también puede influir la penetración. Este protocolo no ha sido probado en peces mayores de 14 días de edad (aproximadamente 7 mm de longitud). Para solucionar problemas de coloración, se recomienda modificar los pasos de penetración fijación, bloqueo y anticuerpo. También es importante examinar la conservación de la secuencia del inmunógeno con la proteína de a. mexicanus de interés utilizando el genoma disponible25.
A. mexicanus es un excelente modelo para investigar la evolución como las poblaciones de la misma especie que ha evolucionado en ambientes radicalmente diferentes pueden compararse directamente en el laboratorio. Protocolos de cría estándar, tanto dentro como entre los laboratorios, son esenciales para la comprensión de las diferencias biológicas entre peces de superficie y cavefish. El artículo proporciona un método para examinar el desarrollo y actividad de los genes en post larvas peces expuestos en parámetros de crecimiento constante.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabajo fue apoyado por subvenciones de los institutos nacionales de salud [HD089934, DK108495].
Materials
| methylene blue | Kordon | B016CBHZUS | antifungal |
| heater | Finnex | 4711457836017 | 100W Digital Control Heater |
| airstone | Lee's Aquarium & Pet Products | 10838125202 | disposable air stone |
| salt | Instant Ocean | 51378014021 | Sea Salt |
| nursery container | IPC | 21545-002 | 40 oz or 1.5 L clear containers |
| transfer pipette | VWR | 414004-002 | plastic bulb pipettes |
| compact culture system(CCS) starter kit with Brachionus plicatilis (L-type) rotifers | Reed Mariculture | na | fish food |
| RGcomplete | APBreed | 817656016572 | 32 oz bottle of rotifer food |
| Programmable Auto Dosing Pump DP-4 | Jebao | DP-4 | automatic feeder for rotifers |
| Tricane-S | Western Chemical | MS 222 | fish anesthetic |
| sodium bicarbonate | Sigma-Aldrich | S5761-500G | for tricane solution |
| nylon mesh strainer | HIC (Harold Import Co.) | 735343476235 | 3-inch diameter |
| Formalin solution, neutral buffered, 10% | Sigma-Aldrich | HT501128-4L | fixative |
| 10X PBS | Invitrogen | AM9625 | buffer, dilute to 1X using distilled water |
| Triton-x 100 | Sigma-Aldrich | T8787-250ML | detergent |
| sodium azide | Sigma-Aldrich | S2002-25G | anti-bacterial |
| bovine serum albumin | Sigma-Aldrich | A9647-100G | blocking reagent |
| glass vial with screw-top cap 4mL | Wheaton | 224742 | staining vial |
| plastic mesh screen for breeding tank | Pentair | N1670 | Cut into a rectangle 6mm larger on all edges than the dimensions of the bottom of the breeding tank. Cut a 6mm square from each corner of the rectangle. Bend the edges of the screen down along all four edges.Place a pair of 6mm vinyl-coated disk magnets on either side (top and bottom) of the mesh on each corner. The screen should be as snug as possible to the sides of the tank. The screen can be removed from the tank with a metal fish net. |
| vinyl-coated disk magnets | Kjmagnets | D84PC-AST | |
| New Life Spectrum Thera-A pellet fish food | New Life International | na | Adult fish food. A list of retailers for this product is available on the company website |
| Antibodies | |||
| insulin antibody from guinea pig | Dako | A0564 | 1:200 |
| glucagon antibody from sheep | Abcam | ab36215 | 1:200 |
| acetylated tubulin antibody from mouse | Sigma | T6793 | 1:500 |
| HuD/HuC antibody from mouse | Life Technologies | A-21271 | 1:500 |
| nitric oxide synthase (nNOS) antibody from rabbit | Abcam | ab106417 | 5μg/mL |
| choline acetyltransferase (ChAT) from rabbit | Abcam | ab178850 | 1:2000 |
| seratonin (5HT) from rabbit | Immunostar | 20080 | 1:500 |
References
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