Cuantificación de basados en citometría de flujo multicolor de las mitocondrias y los lisosomas en las células T
Summary
Este artículo ilustra un método eficaz para cuantificar las mitocondrias o lisosomas en las células vivas. La combinación de tintes específicos lisosomas o las mitocondrias con fluorescente conjugados anticuerpos contra marcadores de superficie permite la cuantificación de estos orgánulos en poblaciones de mezclado de la célula, como células primarias extraídas muestras de tejido, mediante el uso de Citometría de flujo multicolor.
Abstract
Las células de T utilizan diferentes programas metabólicos para que coincida con sus necesidades funcionales durante la diferenciación y proliferación. Las mitocondrias son componentes celulares cruciales responsables de suministro de energía de la célula; sin embargo, las mitocondrias exceso también producen especies reactivas de oxígeno (ROS) que podrían causar la muerte celular. Por lo tanto, el número de mitocondrias debe ajustarse constantemente para satisfacer las necesidades de las células. Esta regulación dinámica se consigue en parte mediante la función de los lisosomas que eliminar macromoléculas y organelos superávit o dañado. Por lo tanto, contenido lisosomal y mitocondrial celular es indicadores clave para evaluar la regulación metabólica de las células. Con el desarrollo de sondas para organelos, bien caracterizado lisosoma o tintes específicos de las mitocondrias se han convertido en disponibles en varios formatos para etiquetar las mitocondrias y los lisosomas celulares. Citometría de flujo multicolor es una herramienta común a fenotipos de células de perfil y tiene la capacidad de integrarse con otros ensayos. Aquí, presentamos un protocolo detallado de cómo combinar tintes organelas específicas con marcadores de superficie de tinción para medir la cantidad de lisosomas y mitocondrias en la célula de T de diferentes poblaciones en un citómetro de flujo.
Introduction
La activación y proliferación de células T son pasos críticos para montar respuesta inmune exitosa. Los avances recientes sugieren que el metabolismo celular está estrechamente asociado con el desarrollo y funciones de las células. Por ejemplo, las células Naive T dependen en gran medida fosforilación oxidativa (OXPHOS) para satisfacer la demanda de energía durante la recirculación entre los órganos linfoides secundarios. Tras la activación, ingenuo T células sufren drásticas reprogramación metabólica, incluyendo la inducción de la glucólisis aeróbica para aumentar la producción de ATP y para satisfacer las demandas metabólicas tremenda durante la proliferación y diferenciación celular. Las células que no siga a través de las necesidades metabólicas mueren por apoptosis1,2. Durante la reprogramación metabólica, las mitocondrias tienen un papel importante ya que son los organelos en gran parte responsables de la producción de ATP para suministrar energía para la célula, y el contenido de la mitocondria celular fluctúa durante cambios metabólicos a lo largo del desarrollo y la activación de la célula de T3. Sin embargo, la acumulación de mitocondrias superfluas o dañadas puede producir exceso ROS que dañan los lípidos, proteínas y ADN y eventualmente puede conducir a la célula de la muerte4
La mitocondria excesiva o daña resultante de alteraciones del metabolismo es eliminada mediante una forma especializada de autofagia5, conocida como mitofagia. Las mitocondrias son envuelto por autophagosomes y luego se fusionan con lisosomas para su degradación. Estos cierran comunicaciones entre mitocondrias y lisosomas han generado gran interés6,7. Por ejemplo, el estrés oxidativo estimula las mitocondrias para formar vesículas derivadas de las mitocondrias (MDVs) que se dirigen a los lisosomas para su degradación en un homólogo de fosfatasa y tensina (PTEN)-inducida supuesta quinasa 1 (PINK1) y parkin (un E3 ubiquitina ligasa) manera dependiente8. Se encontró también que mitofagia es esencial para la transición de color beige con blanco adipocito9,10. Lisosomas son lo más importante, no sólo un compartimiento de degradación, pero también un regulador de la señalización celular. Acumulación de sustrato excesiva debido a las deficiencias de la enzima resulta en disfunción lisosomal alteran la permeabilidad de la membrana lisosomal y afecta a Ca2 + homeostasis11. Los defectos funcionales de la célula de T en la lipasa ácida lysosomal (LAL)12 o lysosomal metabolito transportador knockout mouse modelo13 adicional demostraron la importancia de los lisosomas en el mantenimiento de la homeostasis de la célula de T. Lisosomas y las mitocondrias son partes inseparables de regulación metabólica celular. Por lo tanto, la medición del contenido mitocondrial celular ha sido un indicador fundamental para evaluar el estado metabólico y funcional de la célula de T.
Ensayos usados para cuantificar el contenido lisosomal o mitocondrial celular incluyen immunoblot, microscopía electrónica, tinción de inmunofluorescencia (IF) y análisis por PCR de mitocondrial ADN copia números14,15, 16. mientras immunoblot puede comparar cuantitativamente los niveles de proteínas en diferentes muestras y electrón o si la microscopia puede visualizar las características morfológicas de estos organelos17, estos ensayos tienen ciertos inconvenientes técnicos. Por ejemplo, es mucho tiempo para adquirir un número suficiente de imágenes de células con alta magnificación y resolución o para comparar los niveles de expresión de una proteína a través de decenas de muestras, hacer estos ensayos considerados métodos de bajo rendimiento. Además, estos ensayos pueden aplicarse sólo a la población celular homogénea, como líneas celulares, pero no a las muestras de tejido que se componen de poblaciones mixtas.
También es difícil para estos ensayos se aplican a poblaciones raras, para que el requisito de la mínima célula números de 106 a 108 es imposible de cumplir. Finalmente, las células son generalmente lisis o fijo durante el proceso, lo que los hace incompatibles con otros métodos para extraer más información. En comparación con los métodos tradicionales, citometría de flujo fluorescente-basado tiene un relativamente alto rendimiento – la información de todas las células dentro de una muestra compuesta por poblaciones de mezclado de la célula puede ser analizada y recopilada simultáneamente. Además, uno puede detectar más de 10 parámetros en la misma celda y ordenar las células basadas en fenotipos deseados para otros ensayos. Sondas fluorescentes reactivas han sido usadas para etiqueta de lisosomas y mitocondrias en células vivas y pueden ser detectadas por el flujo cytometry18,19. Estas sondas específicas de organelo celular permeable y tengan características fisico-químicas que permiten que se concentre en localizaciones subcelulares específicas u organelos. Convenientemente, estas sondas están disponibles en varios formatos fluorescentes, lo que permite su aplicación para el análisis multicolor.
Este protocolo describe en detalle cómo combinar marcador superficial de tinción con colorantes específicos lisosomas o las mitocondrias a los lisosomas de etiqueta o viven de las mitocondrias en las células. Esto es especialmente útil para muestras generadas de los principales tejidos y órganos, que a menudo se componen de poblaciones celulares heterogéneas. Los investigadores pueden identificar poblaciones celulares de interés por su expresión superficial del marcador y medir específicamente el contenido lisosomal o mitocondrial a través de tintes de organelas específicas en estas células. Aquí, demostramos el procedimiento detallado de análisis cytometric del flujo que evalúa la masa lisosomal o mitocondrial en las subpoblaciones principales esplénico T cell.
Protocol
Representative Results
Discussion
Este protocolo combina tintes específicos de organelas y marcador superficial de coloración para cuantificar la cantidad de mitocondrias o lisosomas en poblaciones de células T diferentes. Este método fue desarrollado para superar la limitación de los requisitos de número y homogeneidad celular por métodos tradicionales, como la microscopia electrónica y el análisis de immunoblot. Es especialmente útil en el análisis de poblaciones celulares raros y examinar simultáneamente múltiples tipos de células al mis…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
El desarrollo de este protocolo fue apoyado por becas de Taiwán Ministerio de ciencia y tecnología (MOST) NSC103-2320-B-010-002-MY2 y MOST104-2628-B-010-002-MY4 a C.L. Hsu. C.W. Wei es un receptor de excelente tesis Premio del Instituto de Microbiología e Inmunología, Universidad Nacional de Yang Ming.
Materials
| 10 cm Graefe forceps (straight and serrated) | Dimeda | ||
| 11 cm Iris scissors (straight with sharp/sharp heads) | Dimeda | ||
| 15 mL centrifuge tube | Thermo Fisher Scientific | 339650 | |
| 5 mL syringe | TERUMO | ||
| 6 cm Petri dish | α-plus | ||
| 70 µm nylon cell strainer | SPL Lifesciences | 93070 | |
| Ammonium chloride (NH4Cl) | Sigma | A9434 | |
| Anti-mouse CD25 | Biolegend | 102007 | Clone:PC61 |
| Anti-mouse CD4 | Biolegend | 100453 | Clone:GK1.5 |
| Anti-mouse CD44 | Biolegend | 103029 | Clone:IM7 |
| Anti-mouse CD62L | Biolegend | 104407 | Clone:MEL-14 |
| Anti-mouse CD8 | Biolegend | 100713 | Clone:53-6.7 |
| Anti-mouse TCRβ | Biolegend | 109233 | Clone:H57-579 |
| BD LSRFortessa | BD Biosciences | ||
| Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) | Bio basic | 6381-92-6 | |
| FALCON 5ml Polystyrene Round-Bottom Tube (FACS tube) | BD Biosciences | 352052 | |
| FcRgamma II (CD32) Hybridoma (2.4G2) | ATCC | HB-197 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Hyclone | ATD161145 | |
| Flowjo, LLC | BD Biosciences | ||
| Hydroxyethyl piperazineethanesulfonic acid (HEPES) | Sigma | H4034 | |
| L-glutamine (200 mM) | Gibco | A2916801 | |
| LysoTracker Green DND26 | Thermo Fisher Scientific | L7526 | |
| MEM Non-essential amino acids (100X) | Gibco | 11140050 | |
| MitoTracker Green FM | Thermo Fisher Scientific | M7514 | |
| Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) | Gibco | 15140122 | |
| Potassium bicarbonate (KHCO3) | J.T.baker | 298-14-6 | |
| Propidium iodide solution | Sigma | 25535-16-4 | |
| RPMI 1640 medium (powder) | Gibco | 31800089 | |
| Sodium bicarbonate (NaHCO3) | Sigma | S5761 | |
| Sodium pyruvate (100 mM) | Gibco | 11360070 |
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