Çok renkli akış sitometresi tabanlı Quantification mitokondri ve T hücrelerde organellerin
Summary
Bu makalede mitokondri veya canlı hücrelerde organellerin ölçmek için güçlü bir yöntem gösterilmektedir. Primer hücre kullanarak doku örnekleri, hasat gibi karma hücre nüfus bu organelleri miktar lysosome veya mitokondri özel boyalar yüzey işaretleyicileri karşı fluorescently konjuge antikorlar ile kombinasyonu sağlar çok renkli akış sitometresi.
Abstract
T hücreleri farklı metabolik programlarının farklılaşma ve yayılması sırasında fonksiyonel kendi ihtiyaçlarına uygun kullanmaktadır. Mitokondri çok önemli hücresel bileşenleri hücre enerji sağlamak için sorumlu vardır; Ancak, aşırı mitokondri Ayrıca reaktif oksijen türleri (ROS) hücre ölümüne neden olabilir üretmek. Bu nedenle, mitokondri sayısı sürekli hücreleri ihtiyaçlarınıza uygun şekilde ayarlanması gerekir. Bu dinamik yönetmelik kısmen artı/hasarlı organelleri ve oluştururlar kaldırmak organellerin işlevi elde edilir. Bu nedenle, hücresel mitokondrial ve lizozomal içeriği hücre metabolik ayarlama değerlendirmek için anahtar göstergeler vardır. Probları organelleri için gelişmesiyle birlikte, iyi karakterize lysosome veya mitokondri özel boyalar hücresel organellerin ve mitokondri etiketlemek için çeşitli biçimlerde kullanılabilir hale gelmiştir. Çok renkli akış sitometresi profil hücre fenotipleri için ortak bir araç ve diğer deneyleri ile entegre olmak için yeteneği vardır. Burada, bir akış sitometresi organellerin ve mitokondri farklı T hücre Nüfus miktarını ölçmek için boyama yüzey imleçli organel özel boyalar birleştirmek nasıl ayrıntılı bir iletişim kuralı mevcut.
Introduction
Harekete geçirmek ve T hücrelerin çoğalması başarılı bağışıklık yanıtı montaj için önemli adımlardır. Son gelişmeler hücresel metabolizma sıkıca geliştirme ve T hücrelerinin işlevleri ile ilişkili olduğunu göstermektedir. Örneğin, saf T hücreleri büyük ölçüde Oksidatif fosforilasyon (OXPHOS) ikincil lenfoid organlar arasında devridaim sırasında enerji talebi karşılamak için güveniyor. Harekete geçirmek, saf T hücreleri ciddi metabolik, aerobik glikoliz ATP üretimi artırmak için ve hücre farklılaşma ve yayılması sırasında muazzam metabolik talepleri yerine getirmek için indüksiyon dahil olmak üzere yeniden programlama tabi. Metabolik ihtiyaçları ile takip etmek başarısız hücreleri ölmek apoptosis1,2. Metabolik yeniden sırasında programlama mitokondri önemli roller organelleri ATP hücrenin enerji sağlamak için üretim büyük ölçüde sorumlu olduklarını ve metabolik anahtarları sırasında hücresel mitokondri içeriği değişir bu yana oynamak T hücre gelişimi ve harekete geçirmek3. Ancak, gereksiz ya da zarar mitokondri birikimi yağlar, proteinler ve DNA zarar ve sonunda ölüm4 hücre için yol açabilir aşırı ROS üretebilir
Metabolik değişiklikler sonucu aşırı ya da zarar mitokondri autophagy5mitophagy bilinen, özel bir tür tarafından kaldırılır. Mitokondri autophagosomes tarafından sarılmış ve bozulması için organellerin ile erimiş. Bu mitokondri arasındaki iletişimi kapatın ve organellerin büyük ilgi6,7oluşturmuş. Örneğin, oksidatif stres mitokondri organellerin fosfataz ve tensin homolog (PTEN) bozulması için hedeflenen mitokondri kaynaklı veziküller (MDVs) oluşturmak için uyarır-sözde kinaz 1 (PINK1) indüklenen ve parkin (bir E3 Ubikuitin ligaz) bağımlı bir şekilde8. Bu da o mitophagy bej beyaz adipocyte geçiş9,10için gerekli bulundu. Daha da önemlisi, organellerin sadece bir bozulma bölme değildir, ancak aynı zamanda hücresel sinyal bir regülatör. Enzim eksiklikleri nedeniyle aşırı substrat birikimi lizozomal disfonksiyonu lizozomal membran geçirgenliği kesintiye tarafından sonuçlar ve Ca2 + homeostazı11etkiler. T hücre fonksiyonel kusurları lizozomal asit lipaz (LAL)12 veya lizozomal metaboliti ışınlama nakavt fare modeli13 daha fazla T hücre homeostazı korumada organellerin önemini gösterdi. Mitokondri ve organellerin hücresel metabolik regülasyon ayrılmaz parçalarıdır. Bu yüzden, ölçüm-in hücresel mitokondrial içerik T hücre metabolik ve fonksiyonel durumu değerlendirmek için çok önemli bir göstergesi olmuştur.
Hücresel mitokondrial veya lizozomal içeriği ölçmek için yaygın olarak kullanılan deneyleri dahil immunoblot, elektron mikroskobu, immünfloresan (Eğer) boyama ve PCR analizleri mitokondrial DNA kopya sayıları14,15, 16. immunoblot kantitatif protein düzeyleri farklı örnekleri ve elektron veya mikroskobu bu organelleri17morfolojik işaretlerinden görselleştirebilirsiniz arasında mukayese edebilirsiniz iken, bu deneyleri teknik bazı dezavantajları ayı. Örneğin, zaman alıcı yeterli sayıda hücre imge ile yüksek büyütme ve çözünürlük elde etmek için veya bir protein ifade seviyede iş hızı düşük yöntemleri olarak kabul bu deneyleri yapma örnekleri, onlarca arasında karşılaştırmak için bu. Ayrıca, bu deneyleri homojen hücre nüfus, hücre hatları gibi ama değil karışık nüfus oluşan doku örnekleri yalnızca uygulanabilir.
Nadir nüfus için en az hücresi şartı numaraları 10’dan, bu deneyleri uygulamak zordur6 -108 karşılamak imkansız. Son olarak, hücreleri genellikle lysed veya onları daha fazla bilgi almak için diğer yöntemleri ile uyumlu yapma işlemi sırasında sabit. Geleneksel yöntemlere göre floresan tabanlı akış sitometresi nispeten yüksek üretilen iş sahip – analiz ve aynı anda toplanan tüm hücrelerin bir örnek içinde oluşan karma hücre nüfus bilgileri. Buna ek olarak, bir aynı hücre üzerinde 10’dan fazla parametre algılayabilir ve daha fazla deneyleri için istenen fenotipleri dayalı hücreleri sıralamak. Reaktif floresan problar organellerin ve canlı hücrelerde mitokondri etiketlemek için kullanılan ve akış sitometresi18,19tarafından algılanabilir. Bu organel özgü sonda hücre geçirgen vardır ve belirli hücre altı konumları veya organelleri konsantre oldum kurmalarına izin fiziko-kimyasal özelliklere sahip. Elverişli bir konuma sahip, bu probları böylece onların uygulama çok renkli analiz için etkinleştirme çeşitli biçimlerde floresan, uygundur.
Bu iletişim kuralı ayrıntılı olarak anlatılmaktadır nasıl lysosome veya mitokondri özel boyalar için etiket organellerin ile boyama yüzey marker birleştirmek veya hücreleri mitokondri içinde yaşamak. Bu birincil doku ve organlar, kez türdeş olmayan hücre popülasyonlarının oluşan üretilen örnekler için özellikle yararlıdır. Araştırmacılar hücre popülasyonlarının ilgi onların yüzey marker ifade tarafından tanımlayabilir ve özellikle bu hücrelerde organel özel boyalar ile lizozomal veya mitokondrial içeriği ölçmek. Burada, biz büyük dalak T hücre altgrupları lizozomal veya mitokondrial Große değerlendirir akış sitometrik analizin ayrıntılı yordam göstermek.
Protocol
Representative Results
Discussion
Bu iletişim kuralı organel özel boyalar ve yüzey marker mitokondri veya organellerin farklı T hücre Nüfus miktarını ölçmek için boyama birleştirir. Bu yöntem elektron mikroskobu ve immunoblot analiz gibi geleneksel yöntemleri için hücre sayısı ve homojenliği gereksinimleri sınırlamayı aşmak için geliştirilmiştir. Nadir hücre popülasyonlarının analiz ve aynı anda birden çok hücre tipleri aynı zamanda incelenmesi özellikle yararlıdır.
İşlem süresi ve kulu…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Bu iletişim kuralı geliştirilmesi hibe Tayvan Bakanlığı Bilim ve teknoloji (en) NSC103-2320-B-010-002-MY2 ve MOST104-2628-B-010-002-MY4 CL Hsu tarafından desteklenmiştir. CW Wei mükemmel Tez Ödülü, Enstitüsü Mikrobiyoloji ve İmmünoloji, Ulusal Yang Ming Üniversitesi bir alıcı var.
Materials
| 10 cm Graefe forceps (straight and serrated) | Dimeda | ||
| 11 cm Iris scissors (straight with sharp/sharp heads) | Dimeda | ||
| 15 mL centrifuge tube | Thermo Fisher Scientific | 339650 | |
| 5 mL syringe | TERUMO | ||
| 6 cm Petri dish | α-plus | ||
| 70 µm nylon cell strainer | SPL Lifesciences | 93070 | |
| Ammonium chloride (NH4Cl) | Sigma | A9434 | |
| Anti-mouse CD25 | Biolegend | 102007 | Clone:PC61 |
| Anti-mouse CD4 | Biolegend | 100453 | Clone:GK1.5 |
| Anti-mouse CD44 | Biolegend | 103029 | Clone:IM7 |
| Anti-mouse CD62L | Biolegend | 104407 | Clone:MEL-14 |
| Anti-mouse CD8 | Biolegend | 100713 | Clone:53-6.7 |
| Anti-mouse TCRβ | Biolegend | 109233 | Clone:H57-579 |
| BD LSRFortessa | BD Biosciences | ||
| Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) | Bio basic | 6381-92-6 | |
| FALCON 5ml Polystyrene Round-Bottom Tube (FACS tube) | BD Biosciences | 352052 | |
| FcRgamma II (CD32) Hybridoma (2.4G2) | ATCC | HB-197 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Hyclone | ATD161145 | |
| Flowjo, LLC | BD Biosciences | ||
| Hydroxyethyl piperazineethanesulfonic acid (HEPES) | Sigma | H4034 | |
| L-glutamine (200 mM) | Gibco | A2916801 | |
| LysoTracker Green DND26 | Thermo Fisher Scientific | L7526 | |
| MEM Non-essential amino acids (100X) | Gibco | 11140050 | |
| MitoTracker Green FM | Thermo Fisher Scientific | M7514 | |
| Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) | Gibco | 15140122 | |
| Potassium bicarbonate (KHCO3) | J.T.baker | 298-14-6 | |
| Propidium iodide solution | Sigma | 25535-16-4 | |
| RPMI 1640 medium (powder) | Gibco | 31800089 | |
| Sodium bicarbonate (NaHCO3) | Sigma | S5761 | |
| Sodium pyruvate (100 mM) | Gibco | 11360070 |
References
- Buck, M. D., O’Sullivan, D., Pearce, E. L. T cell metabolism drives immunity. Journal of Experimental Medicine. 212 (9), 1345-1360 (2015).
- Marelli-Berg, F. M., Fu, H., Mauro, C. Molecular mechanisms of metabolic reprogramming in proliferating cells: implications for T-cell-mediated immunity. Immunology. 136 (4), 363-369 (2012).
- Pua, H. H., Guo, J., Komatsu, M., He, Y. W. Autophagy is essential for mitochondrial clearance in mature T lymphocytes. The Journal of Immunology. 182 (7), 4046-4055 (2009).
- Chao, T., Wang, H., Ho, P. C. Mitochondrial Control and Guidance of Cellular Activities of T Cells. Frontiers in Immunology. 8, 473 (2017).
- Youle, R. J., Narendra, D. P. Mechanisms of mitophagy. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 12 (1), 9-14 (2011).
- Diogo, C. V., Yambire, K. F., Fernández Mosquera, L., Branco, F. T., Raimundo, N. Mitochondrial adventures at the organelle society. Biochemical and Biophysical Research Communications. 500 (1), 87-93 (2018).
- Todkar, K., Ilamathi, H. S., Germain, M. Mitochondria and Lysosomes: Discovering Bonds. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 5, 106 (2017).
- McLelland, G. L., Soubannier, V., Chen, C. X., McBride, H. M., Fon, E. A. Parkin and PINK1 function in a vesicular trafficking pathway regulating mitochondrial quality control. The EMBO Journal. 33 (4), 282 (2014).
- Wrighton, K. H. Metabolism: Mitophagy turns beige adipocytes white. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 17 (10), 607 (2016).
- Altshuler-Keylin, S., et al. Beige Adipocyte Maintenance Is Regulated by Autophagy-Induced Mitochondrial Clearance. Cell Metabolism. 24 (3), 402-419 (2016).
- Settembre, C., Fraldi, A., Medina, D. L., Ballabio, A. Signals from the lysosome: a control centre for cellular clearance and energy metabolism. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 14 (5), 283-296 (2013).
- Qu, P., Du, H., Wilkes, D. S., Yan, C. Critical roles of lysosomal acid lipase in T cell development and function. The American Journal of Pathology. 174 (3), 944-956 (2009).
- Wei, C. W., et al. Equilibrative Nucleoside Transporter 3 Regulates T Cell Homeostasis by Coordinating Lysosomal Function with Nucleoside Availability. Cell Reports. 23 (8), 2330-2341 (2018).
- Baixauli, F., et al. Mitochondrial Respiration Controls Lysosomal Function during Inflammatory T Cell Responses. Cell Metabolism. 22 (3), 485-498 (2015).
- Piantadosi, C. A., Suliman, H. B. Mitochondrial transcription factor A induction by redox activation of nuclear respiratory factor 1. The Journal of Biological Chemistry. 281 (1), 324-333 (2006).
- Zhu, Y., et al. Constitutive association of the proapoptotic protein Bim with Bcl-2-related proteins on mitochondria in T cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101 (20), 7681-7686 (2004).
- Ding, W. X., Yin, X. M. Mitophagy: mechanisms, pathophysiological roles, and analysis. Biological Chemistry. 393 (7), 547-564 (2012).
- van der Windt, G. J. W., et al. CD8 memory T cells have a bioenergetic advantage that underlies their rapid recall ability. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (35), 14336 (2013).
- Chikte, S., Panchal, N., Warnes, G. Use of Lyso dyes: A flow cytometric study of autophagy. Cytometry Part A. 85 (2), 169-178 (2013).
- Allan, A. L., Keeney, M. Circulating tumor cell analysis: technical and statistical considerations for application to the clinic. Journal of Oncology. 2010, 426218 (2010).
- Curtsinger, J. M., Lins, D. C., Johnson, C. M., Mescher, M. F. Signal 3 tolerant CD8 T cells degranulate in response to antigen but lack granzyme B to mediate cytolysis. The Journal of Immunology. 175 (7), 4392-4399 (2005).
- Wolint, P., Betts, M. R., Koup, R. A., Oxenius, A. Immediate cytotoxicity but not degranulation distinguishes effector and memory subsets of CD8+ T cells. Journal of Experimental Medicine. 199 (7), 925-936 (2004).
- Van den Bossche, J., et al. Mitochondrial Dysfunction Prevents Repolarization of Inflammatory Macrophages. Cell Reports. 17 (3), 684-696 (2016).
- Pearce, E. J., Everts, B. Dendritic cell metabolism. Nature Reviews Immunology. 15 (1), 18-29 (2015).
- Dugnani, E., et al. Integrating T cell metabolism in cancer immunotherapy. Cancer Letters. 411, 12-18 (2017).
- Yang, Z., Matteson, E. L., Goronzy, J. J., Weyand, C. M. T-cell metabolism in autoimmune disease. Arthritis Research & Therapy. 17 (1), 29 (2015).
