Multicolor Stroom Cytometry gebaseerde kwantificering van Mitochondria en lysosomen in T cellen

De activering en de proliferatie van T cellen zijn kritische stappen voor de montage van de succesvolle immuunrespons. Recente vooruitgang suggereren dat het cellulaire metabolisme strak gekoppeld aan zowel de ontwikkeling en de functies van T-cellen is. Bijvoorbeeld, vertrouwen naïef T cellen grotendeels op oxidatieve fosforylatie (OXPHOS) om te voldoen aan de vraag naar energie tijdens de recirculatie onder secundaire lymfoïde organen. Na activatie ondergaan naïef T cellen drastische metabole herprogrammering, met inbegrip van de inductie van aërobe glycolyse ATP productie te verhogen en om te voldoen aan de enorme metabole eisen tijdens celdifferentiatie en proliferatie. De cellen die niet te volgen via de metabolische behoeften sterven door apoptosis^1,2. Tijdens de metabole herprogrammering, spelen mitochondria een belangrijke rol omdat zij de organellen grotendeels verantwoordelijk voor de productie van ATP om energie voor de cel, en de inhoud van de cellulaire mitochondriën tijdens metabole schakelaars schommelt in de gehele T cel ontwikkeling en activering³. Echter, de accumulatie van overtollige of beschadigde mitochondriën overtollige ROS die schade van DNA, lipiden en proteïnen, en kan uiteindelijk leiden tot de dood⁴ cel kan produceren

De mitochondriën van het overmatig of beschadigd ten gevolge van metabolische omzetting worden verwijderd door een gespecialiseerde vorm van autophagy⁵, bekend als mitophagy. Mitochondriën zijn verpakt door autophagosomes en vervolgens gesmolten met lysosomen voor afbraak. Dit sluit communicatie tussen mitochondriën en lysosomen hebben gegenereerd grote belangstelling^6,7. Bijvoorbeeld, oxidatieve stress stimuleert mitochondriën om te vormen van de mitochondriën-derived vesicles (MDVs) die op lysosomen voor afbraak in een fosfatase en Tenzin homolog (PTEN gericht zijn)-geïnduceerde putatief kinase 1 (PINK1) en parkin (een E3 ubiquitin ligase) afhankelijke wijze⁸. Ook bleek dat mitophagy is essentieel voor beige-naar-wit adipocyte overgang^9,10. Nog belangrijker, zijn lysosomen niet alleen een aantasting van het compartiment, maar ook een regulator van cellulaire signalering. Buitensporige substraat accumulatie te wijten aan de tekortkomingen van het enzym leidt tot een lysosomale dysfunctie door het verstoren van de lysosomale membraan permeabiliteit en Ca^{2 +} homeostase¹¹beïnvloedt. De T cel functionele defecten in lysosomale zure lipase (LAL)¹² of lysosomale metaboliet vervoerder knockout muis model¹³ bleek verder het belang van lysosomen in het handhaven van de T cel homeostase. Mitochondriën zowel lysosomen zijn onlosmakelijk met elkaar verbonden delen van cellulaire metabole verordening. Daarom is de meting van het cellulaire mitochondriale een cruciale indicator om te evalueren van de T cel metabole en functionele status geweest.

Gebruikte te kwantificeren van cellulaire mitochondriale of lysosomale inhoud testen omvatten immunoblot, elektronenmicroscopie immunefluorescentie (IF) kleuring en PCR analyse van mitochondriaal DNA kopie nummers^{14,15, 16}. terwijl immunoblot kwantitatief eiwitniveaus over verschillende monsters en elektron of vergelijken kan als microscopie morfologische kenmerken van deze organellen¹⁷kunt visualiseren, deze gehaltebepalingen dragen bepaalde technische nadelen. Bijvoorbeeld, is het tijdrovend te verwerven van voldoende aantal cel beelden met hoge vergroting en resolutie of wilt vergelijken in de niveaus van de expressie van een proteïne over tientallen monsters, maken deze gehaltebepalingen beschouwd als lage doorvoersnelheid methoden. Deze testen kunnen bovendien alleen worden toegepast, tot homogene celpopulatie, zoals cellijnen, maar niet tot weefselsteekproeven dat bestaat uit een gemengde bevolking.

Het is ook moeilijk toe te passen deze gehaltebepalingen op zeldzame populaties, waarvoor de eis voor minimale cel nummers van 10⁶ tot 10⁸ onmogelijk is om te voldoen aan. Ten slotte, cellen zijn meestal lysed of vaste tijdens het proces, waardoor ze onverenigbaar zijn met andere methoden verder om informatie te extraheren. Vergeleken met de traditionele methoden, TL gebaseerde stroom cytometry heeft een relatief hoge doorvoersnelheid – de informatie van alle cellen binnen een steekproef samengesteld van gemengde cel bevolking kan worden geanalyseerd en gelijktijdig verzameld. Daarnaast kan detecteren meer dan 10 parameters op dezelfde cel en sorteren van de cellen op basis van gewenste fenotypen voor verdere testen. Reactieve fluorescerende sondes zijn gebruikt om het label lysosomen- en mitochondriën in levende cellen en kunnen worden gedetecteerd door stroom cytometry^18,19. Deze organel-specifieke sondes zijn cel doorlaatbare en fysisch-chemische eigenschappen die de mogelijkheid moet worden geconcentreerd in de specifieke subcellular locaties of organellen. Deze sondes zijn gunstig, beschikbaar in verschillende TL formaten, zodat hun toepassing voor multicolor analyse.

Dit protocol beschrijft in detail hoe combineren oppervlakte marker kleuring met lysosoom – of mitochondriën-specifieke kleurstoffen aan label lysosomen of mitochondriën in levende cellen. Dit is vooral handig voor monsters die zijn gegenereerd op basis van primaire weefsels en organen, die vaak bestaan uit heterogene cel populaties. Onderzoekers kunnen identificeren cel populaties van belang door hun oppervlakte marker-expressie en specifiek meten de lysosomale of mitochondrial inhoud via organel-specifieke kleurstoffen in deze cellen. Hier tonen we de gedetailleerde procedure voor flow cytometrische analyse die wordt geëvalueerd als de lysosomale of mitochondrial massa in de grote milt T cel subpopulaties.