כימות מבוססי Cytometry זרימה ססגוניות של המיטוכונדריה, Lysosomes בתאי T

הפעלת ושגשוגם של תאי T הם שלבים קריטיים להרכבת תגובות חיסוניות מוצלחת. התפתחויות אחרונות מראים כי החומרים הסלולר קשורה באופן הדוק פיתוח והן פונקציות של תאי T. לדוגמה, תאים נאיביים T מסתמכים בעיקר על זרחון חמצוני (OXPHOS) את הביקוש אנרגיה במהלך מחזור בין איברי הלימפה משני. בעת ההפעלה, תמים T תאים עוברים דרסטית מטבולית התכנות, כולל את אינדוקציה של אירובי גליקוליזה כדי להגביר את ייצור ATP וכדי למלא את דרישות המטבולית אדירה במהלך התמיינות תאים והתפשטות. התאים מתקשה להבין. דרך לצרכים מטבוליים למות על ידי אפופטוזיס^1,2. במהלך התיכנות מטבולית המיטוכונדריה לשחק תפקידים חשובים מאז הם organelles אחראי במידה רבה הייצור של ATP לאספקת אנרגיה של התא, התוכן המיטוכונדריה הסלולר תנודות במהלך מתגים מטבולית ברחבי T cell פיתוח והפעלה³. אולם, ההצטברות של המיטוכונדריה מיותר או פגום יכול לייצר עודפי ROS נזק שומנים, חלבונים ו- DNA, והוא יכול להוביל בסופו של דבר לתא המוות⁴

המיטוכונדריה מוגזם או נזק הנובעים שינויים מטבוליים יוסרו על ידי צורה מיוחדת של autophagy⁵, המכונה mitophagy. המיטוכונדריה הם עטוף autophagosomes, ואז התמזגו עם lysosomes עבור השפלה. אלה סגור תקשורת בין המיטוכונדריה, lysosomes יצרו עניין רב^6,7. לדוגמה, סטרס חמצוני מעוררת את המיטוכונדריה ליצור שלפוחית נגזר המיטוכונדריה (MDVs) המיועדים כדי lysosomes על השפלה פוספטאז, tensin homolog (PTEN)-induced בשם קינאז 1 (PINK1) ואת פרקין (ליגאז אוביקוויטין E3) אופן התלויים⁸. גם נמצאו ש-mitophagy הזה הוא חיוני עבור adipocyte בז ללבן המעבר^9,10. חשוב מכך, lysosomes אינם רק תא השפלה, אלא גם מווסת של איתות. הצטברות מוגזמת המצע עקב ליקויים האנזים מתבטא בתפקוד lysosomal באמצעות שיבוש חדירות הממברנה lysosomal ומשפיע על Ca^{2 +} הומאוסטזיס¹¹. פגמים פונקציונלי תא T ליפאז lysosomal חומצה (LAL)¹² או המטבוליט lysosomal טרנספורטר נוקאאוט העכבר דגם¹³ נוסף הראה את החשיבות של lysosomes בשמירה על הומאוסטזיס תא T. המיטוכונדריה וגם lysosomes הם חלקים בלתי נפרדים של רגולציה חילוף החומרים הסלולר. לכן, מדידה של תכנים סלולריים מיטוכונדריאלי כבר חיווי חיוני כדי להעריך את מצב מטבולי ופונקציונליים של תא T.

מבחני נפוץ לכמת תוכן סלולרי מיטוכונדריאלי או lysosomal כוללים immunoblot, מיקרוסקופ אלקטרונים, immunofluorescent מכתים (אם), וניתוח PCR מיטוכונדריאלי DNA עותק מספרי^{14,15, 16}. בעוד immunoblot יכול באופן כמותי משווים רמות החלבון בין דוגמאות שונות, אלקטרון או אם מיקרוסקופ ניתן להמחיש את מבוקשם מורפולוגי של אלה organelles¹⁷, אלה מבחני לשאת חסרונות טכניים מסוימים. לדוגמה, זה זמן רב כדי לרכוש מספר מספיק של התא תמונות בהגדלה וברזולוציה או להשוות את רמות הביטוי של חלבון על פני עשרות של דגימות, ביצוע מבחני אלה נחשבת שיטות תפוקה נמוכה. יתר על כן, מבחני אלה ניתן להחיל רק אוכלוסייה הומוגנית התא, כגון שורות תאים, אך לא דגימות רקמה המורכב של אוכלוסיות מעורבות.

. זה גם קשה להחיל את מבחני אלה אוכלוסיות נדירה, שבה הדרישה תא מינימלי של מספרים מ-10⁶ עד 10⁸ בלתי אפשרי לפגוש. לבסוף, התאים בדרך כלל lysed או קבוע במהלך תהליך שהופך אותם עולה בקנה אחד עם שיטות אחרות כדי לחלץ מידע נוסף. לעומת שיטות מסורתיות, cytometry זרימה מבוססי פלורסנט בעלת תפוקה גבוהה יחסית של – המידע של כל התאים בטווח מדגם המורכב אוכלוסיות מעורבות לתאים יכול להיות מנותח ואסף בו זמנית. בנוסף, אחד יכול לזהות יותר מ- 10 פרמטרים באותו התא, למיין את התאים בהתאם פנוטיפים הרצוי עבור עוד מבחני. תגובתי הגששים פלורסנט שימשו לה תווית lysosomes, המיטוכונדריה בתאים חיים, ניתן להבחין לזרום cytometry^18,19. הגששים אברון ספציפיים אלה תא חדיר, יש מאפיינים הכימי פיזיקלי, אשר מאפשרות להם מרוכזים מיקומים ספציפיים subcellular או organelles. בנוחות, רגשים אלו זמינים במגוון פורמטים פלורסנט, ובכך מאפשר היישום שלהם לניתוח ססגוניות.

פרוטוקול זה מתאר בפירוט כיצד לשלב סמן משטח מכתים עם ליזוזום-המיטוכונדריה ספציפיים או צבע כדי lysosomes תווית או במיטוכונדריה לחיות תאים. הדבר שימושי במיוחד עבור דגימות המופקים העיקרי רקמות ואיברים, אשר לעיתים קרובות מורכבים של אוכלוסיות הטרוגניות התא. החוקרים ניתן לזהות אוכלוסיות תאים עניין על-ידי ביטוי סמן משטח שלהם, במיוחד למדוד את התוכן lysosomal או מיטוכונדריאלי באמצעות צבעי אברון ספציפי בתאים אלה. . הנה, נדגים ההליך מפורט של ניתוח cytometric תזרים המעריכה את המיסה lysosomal או מיטוכונדריאלי subpopulations תא T הטחול הגדולות.