ミトコンドリア、リソソーム T 細胞のマルチカラー フロー フローサイトメトリーを用いた定量化
Summary
この記事は、ミトコンドリアや細胞内のリソソームを定量化する強力な方法を示しています。リソソームやミトコンドリア固有染料表面マーカー蛍光に活用された抗体との組み合わせにより、初代培養細胞を用いた組織サンプルから収穫のような混合細胞集団におけるこれらのオルガネラの定量化フローサイトメトリー マルチ カラー。
Abstract
T 細胞は、分化と増殖中に機能的なニーズに合わせて、さまざまな代謝プログラムを利用します。ミトコンドリアは細胞エネルギーの供給を行う重要な細胞成分です。ただし、過剰なミトコンドリアも細胞死を引き起こすことができる活性酸素種 (ROS) を生成します。したがって、ミトコンドリアの数は、細胞のニーズに合わせて常に調整する必要があります。このダイナミック制御は、一部剰余金/破損した細胞内小器官と高分子削除リソソームの機能によって実現されます。したがって、細胞のミトコンドリア、リソソーム内容は、細胞の代謝の調整を評価する重要な指標です。細胞内小器官のためのプローブの開発と、よ特徴付けられたリソソームやミトコンドリア固有染料細胞リソソーム、ミトコンドリアのラベルに様々 なフォーマットで利用可能になっています。フローサイトメトリー マルチ カラー プロファイル細胞の表現型に共通のツール、他の試金と統合する機能です。ここでは、流れの cytometer でリソソームと異なる T 細胞集団におけるミトコンドリアの量を測定する染色表面マーカーと細胞小器官特定の染料を結合する方法の詳細なプロトコルを提案する.
Introduction
活性化し、T 細胞の増殖は、正常な免疫応答をマウントするための重要なステップです。最近の進歩は、細胞の代謝がしっかりと開発と T 細胞の機能の両方に関連付けられているが示唆されました。たとえば、ナイーブ T 細胞は、酸化的リン酸化 (OXPHOS) 二次リンパ器官の中で循環の中にエネルギー需要を満たすために大きく依存しています。起動時に、ナイーブ T 細胞は、抜本的な代謝リプログラミング、ATP の生産を増加し、細胞の分化と増殖の間に途方もない代謝要求を満たす好気性解糖作用の誘導を含むを受けます。代謝の必要なフォロースルーに失敗した細胞アポトーシス1,2で死ぬ。彼らは細胞小器官、細胞のエネルギー供給への ATP の生産に対する主な責任と代謝スイッチの中に細胞のミトコンドリアの内容が変動するので、ミトコンドリアが重要な役割を果たす代謝リプログラミング中T 中セルの開発と活性化3を実行します。ただし、不要なまたは破損したミトコンドリアの蓄積は、脂質、蛋白質および DNA を損傷し、最終的に細胞死4につながることができます余分な活性酸素を作り出すことができます。
代謝変化から生じる過剰なまたは破損しているミトコンドリアは、オートファジーの5、mitophagy として知られている特殊な形式で削除されます。ミトコンドリアはオートファゴソームで包装し、劣化のためリソソームと融合し。これらはミトコンドリアの間の通信を閉じてリソソームが大きな関心6,7を生成します。例えば、酸化ストレスがミトコンドリア由来の小胞 (MDVs) ホスファターゼとテンシン相同物 (PTEN) の劣化のリソソームを対象とを形成するミトコンドリアを刺激-推定のキナーゼ 1 (PINK1) を誘発、パーキン (E3 ユビキチンリ ガーゼ)依存する方法8.また、その mitophagy はベージュがかった白色脂肪細胞転移9,10のために不可欠に分られました。もっと重要なは、リソソームは単なる低下のコンパートメントだけでなく、細胞内シグナル伝達の調節因子ではありません。酵素不足による過剰な基板の蓄積はライソゾーム膜の透過性を混乱させることによってリソソーム機能不全の結果し、11の Ca2 +の恒常性に影響を与えます。ライソゾーム酸性リパーゼ (ラル)12またはリソゾーム代謝物トランスポーター ノックアウト マウス モデル13 T 細胞の機能的な欠陥は、T 細胞の恒常性を維持するためにさらにリソソームの重要性を示した。ミトコンドリア、リソソームは、細胞の代謝調節の不可分の部分です。したがって、細胞のミトコンドリア量の測定は、T 細胞の代謝と機能の状態を評価する重要な指標をされています。
イムノブロット、電子顕微鏡、蛍光抗体 (IF) 染色および pcr 法によるミトコンドリア DNA コピー数14,15,のアッセイ一般的細胞ミトコンドリア、リソソーム内容を定量化するために使用が含まれます16. イムノブロットできますさまざまなサンプルや電子顕微鏡は17これらの細胞内小器官の形態学的特徴を可視化できるかどうかにタンパク質レベルを定量的に比較して、これらの試金は特定の技術的な欠点ご。たとえば、それは十分な数の高倍率と分解能と細胞像を取得または低スループット方法と見なされますこれらのアッセイを行うサンプルの多数の間で蛋白質の表現のレベルを比較する時間です。さらに、これらのアッセイは、混合集団から成る組織サンプルでないのに細胞などの同種細胞集団にのみ適用できます。
また、最小セルの要件が 10 から番号を特殊な集団にこれらのアッセイを適用することは困難だ6 108はお会いすること。最後に、セルが通常分離か、さらに情報を抽出する他の方法と互換性がないそれらを作るプロセス中に固定します。従来の方法と比較して、蛍光を用いたフローサイトメトリーが比較的高いスループット – すべてサンプル内のセルから成る混合細胞集団の情報を分析および同時に収集できます。さらに、同じセルに 10 以上のパラメーターを検出、さらに試金のための所望の表現型を基にセルを並べ替えできます。反応性蛍光プローブは、リソソーム、細胞内のミトコンドリアをラベルに使用されているし、流れ cytometry18,19によって検出することができます。細胞小器官のこれらのプローブは、細胞透過性、細胞小器官や細胞内の特定の場所に集中することができます物理化学的特性を持っています。便利なマルチカラー解析に応用ができ、様々 な蛍光の形式でこれらのプローブがあります。
表面マーカー ラベル リソソームにリソソームやミトコンドリア固有染料で染色を結合する方法について詳しく説明このプロトコルまたはミトコンドリアが細胞を住んでいます。これは、主な組織や臓器は、しばしば異種細胞集団から成るから生成されるサンプルのため便利です。研究者は、表面マーカー発現によって興味のセル人口を識別し、これらの細胞の特定の細胞小器官染料をライソゾームやミトコンドリアの内容を具体的に測定できます。ここでは、主要な脾 T リンパ球サブポピュレーションのライソゾームまたはミトコンドリア質量が評価されるフローサイトメトリーによる解析の詳細な手順を示します。
Protocol
Representative Results
Discussion
このプロトコルは細胞器官特定の染料とミトコンドリア、リソソームの異なる T 細胞集団の量を定量化する染色表面マーカーを組み合わせたものです。このメソッドは、イムノブロット分析電子顕微鏡などの従来の方法で細胞数と均質性要件の制限を克服するために開発されました。稀な細胞集団の分析と同時に同時に複数のセルの種類を調べることで特に便利です。
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Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
このプロトコルの開発は、セの許に台湾省、科学および技術 (ほとんど) NSC103-2320-B-010-002-MY2 と MOST104-2628-B-010-002-MY4 からの補助金によって支えられました。C. w. 魏優秀論文賞の微生物学と免疫学、国立陽明大学の受信者であります。
Materials
| 10 cm Graefe forceps (straight and serrated) | Dimeda | ||
| 11 cm Iris scissors (straight with sharp/sharp heads) | Dimeda | ||
| 15 mL centrifuge tube | Thermo Fisher Scientific | 339650 | |
| 5 mL syringe | TERUMO | ||
| 6 cm Petri dish | α-plus | ||
| 70 µm nylon cell strainer | SPL Lifesciences | 93070 | |
| Ammonium chloride (NH4Cl) | Sigma | A9434 | |
| Anti-mouse CD25 | Biolegend | 102007 | Clone:PC61 |
| Anti-mouse CD4 | Biolegend | 100453 | Clone:GK1.5 |
| Anti-mouse CD44 | Biolegend | 103029 | Clone:IM7 |
| Anti-mouse CD62L | Biolegend | 104407 | Clone:MEL-14 |
| Anti-mouse CD8 | Biolegend | 100713 | Clone:53-6.7 |
| Anti-mouse TCRβ | Biolegend | 109233 | Clone:H57-579 |
| BD LSRFortessa | BD Biosciences | ||
| Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) | Bio basic | 6381-92-6 | |
| FALCON 5ml Polystyrene Round-Bottom Tube (FACS tube) | BD Biosciences | 352052 | |
| FcRgamma II (CD32) Hybridoma (2.4G2) | ATCC | HB-197 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Hyclone | ATD161145 | |
| Flowjo, LLC | BD Biosciences | ||
| Hydroxyethyl piperazineethanesulfonic acid (HEPES) | Sigma | H4034 | |
| L-glutamine (200 mM) | Gibco | A2916801 | |
| LysoTracker Green DND26 | Thermo Fisher Scientific | L7526 | |
| MEM Non-essential amino acids (100X) | Gibco | 11140050 | |
| MitoTracker Green FM | Thermo Fisher Scientific | M7514 | |
| Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) | Gibco | 15140122 | |
| Potassium bicarbonate (KHCO3) | J.T.baker | 298-14-6 | |
| Propidium iodide solution | Sigma | 25535-16-4 | |
| RPMI 1640 medium (powder) | Gibco | 31800089 | |
| Sodium bicarbonate (NaHCO3) | Sigma | S5761 | |
| Sodium pyruvate (100 mM) | Gibco | 11360070 |
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