Quantificazione di basata su citometria a flusso multicolor dei mitocondri e lisosomi in cellule di T

L’attivazione e la proliferazione delle cellule di T sono passaggi critici per il successo delle risposte immunitarie di montaggio. Gli avanzamenti recenti suggeriscono che il metabolismo cellulare è strettamente associato con lo sviluppo e la funzioni delle cellule T. Ad esempio, le cellule T naive si basano in gran parte su fosforilazione ossidativa (OXPHOS) per soddisfare la domanda di energia durante il ricircolo tra organi linfoidi secondari. Al momento dell’attivazione, le cellule T naive subiscono drastica metabolica riprogrammazione, compresa l’induzione di glicolisi aerobica per aumentare la produzione di ATP e per soddisfare l’enorme richiesta metabolica durante la proliferazione e differenziazione cellulare. Le cellule che non riescono a seguire attraverso il fabbisogno metabolico die da apoptosi^1,2. Durante la riprogrammazione metabolico, i mitocondri svolgono un ruolo importante poiché essi sono gli organelli in gran parte responsabili per la produzione di ATP per la fornitura di energia per la cellula, e il contenuto di mitocondri cellulari fluttua durante il metabolici interruttori in tutto cellula T sviluppo e attivazione³. Tuttavia, l’accumulo di mitocondri superflui o danneggiati possa produrre ROS in eccesso che danneggiare lipidi, proteine e DNA e può finalmente condurre a cellule morte⁴

I mitocondri danneggiati o eccessivi derivanti da alterazioni metaboliche vengono rimossi da una forma specializzata di autofagia⁵, noto come mitophagy. I mitocondri sono avvolto da autofagosomi e quindi fusi con i lisosomi per la degradazione. Questi vicino comunicazioni tra mitocondri e lisosomi hanno generato grande interesse^6,7. Ad esempio, lo sforzo ossidativo stimola i mitocondri per formare vescicole mitocondri-derivato (MDVs) che sono mirate al lisosomi per la degradazione in un omologo fosfatasi e tensin (PTEN)-indotto putativa chinasi 1 (PINK1) e parkin (una E3 ubiquitina ligasi) modo dipendente⁸. È emerso inoltre che mitophagy è essenziale per la transizione dell’adipocita bianco-beige^9,10. Ancora più importante, i lisosomi non sono semplicemente un vano di degrado, ma anche un regolatore di segnalazione cellulare. Accumulo eccessivo di substrato a causa di carenze di enzima provoca la disfunzione lysosomal interrompendo la permeabilità della membrana lisosomiale e colpisce il Ca^{2 +} omeostasi¹¹. Difetti funzionali delle cellule T in lipasi acida lysosomal (LAL)¹² o metabolita lysosomal transporter knockout mouse modello¹³ ha mostrato ulteriormente l’importanza dei lisosomi nel mantenimento dell’omeostasi delle cellule T. Sia i mitocondri ed i lisosomi sono parti inseparabili di regolazione metabolica cellulare. Misura del contenuto cellulare mitocondriale è stato quindi un indicatore fondamentale per valutare lo stato metabolico e funzionale di cellule T.

Analisi comunemente usate per quantificare il contenuto cellulare mitocondriale o lysosomal includono immunoblot, microscopia elettronica, colorazione di immunofluorescenza (IF) e l’analisi PCR di mitocondriale del DNA copia numeri^{14,15, 16}. mentre immunoblot quantitativamente è in grado di confrontare i livelli della proteina attraverso diversi campioni ed elettrone o se microscopia può visualizzare le caratteristiche morfologiche di questi organelli¹⁷, questi saggi sopportano alcuni inconvenienti tecnici. Ad esempio, è molto tempo per acquisire sufficiente numero di cellulare immagini con alto ingrandimento e risoluzione o per confrontare i livelli di espressione di una proteina attraverso decine di campioni, rendendo questi saggi considerati metodi di basso rendimento. Inoltre, queste analisi possono essere applicate solo a popolazione omogenea delle cellule, ad esempio linee cellulari, ma non per i campioni di tessuto che sono composte da popolazioni miste.

È anche difficile applicare tali saggi a popolazioni rari, per cui il requisito di cellule minimal numeri da 10⁶ -10⁸ è impossibile da rispettare. Infine, le cellule sono solitamente lisate o fisso durante il processo, rendendoli incompatibili con altri metodi per estrarre ulteriori informazioni. Rispetto ai metodi tradizionali, basati su fluorescente flusso cytometry ha un relativamente alto throughput – le informazioni di tutte le celle all’interno di un campione composto da popolazioni miste di cellule possono essere analizzate e raccolti simultaneamente. In più, uno in grado di rilevare più di 10 parametri sulla stessa cellula e ordinare le celle basate sui fenotipi desiderati per ulteriori analisi. Sonde fluorescenti reattivi sono stati usati per etichettare i lisosomi e mitocondri in cellule vive e possono essere rilevati da flusso cytometry^18,19. Queste sonde di organelli specifici sono cellulare permeabile e hanno caratteristiche fisico-chimiche che permettono loro di essere concentrata in determinate località subcellulare o organelli. Convenientemente, queste sonde sono disponibili in vari formati fluorescenti, permettendo così la loro applicazione per l’analisi multicolor.

Questo protocollo viene descritto in dettaglio come combinare marcatore di superficie colorazione con coloranti specifici lisosoma o mitocondri lisosomi etichetta o mitocondri in cellule vivono. Ciò è particolarmente utile per campioni generati da tessuti primari e gli organi, che sono spesso composte da popolazioni eterogenee delle cellule. Ricercatori è in grado di identificare popolazioni cellulari di interesse dalla loro espressione di superficie dell’indicatore e misurare specificamente il contenuto lisosomiale o mitocondriale attraverso degli organelli specifici coloranti in queste cellule. Qui, dimostriamo la procedura dettagliata di analisi cytometric di flusso che valuta la massa lisosomiale o mitocondriale nelle sottopopolazioni principali splenico delle cellule T.