التدفق متعدد الألوان المستندة إلى الخلوي الكمي الميتوكوندريا وليسوسوميس في خلايا تي
Summary
توضح هذه المقالة طريقة قوية تحديد حجم الميتوكوندريا أو ليسوسوميس في الخلايا الحية. مزيج الأصباغ يحلول أو الميتوكوندريا محددة مع الأجسام المضادة مترافق فلوريسسينتلي ضد علامات السطح يسمح التحديد الكمي لهذه العضيات في الخلايا المختلطة السكان، مثل الخلايا الابتدائية تحصد من عينات الأنسجة، باستخدام قياس التدفق متعدد الألوان.
Abstract
خلايا T الاستفادة من البرامج الأيضية المختلفة لتتناسب مع احتياجاتها الوظيفية خلال التمايز وانتشارها. الميتوكوندريا عناصر حاسمة الخلوية المسؤولة عن إمداد الطاقة الخلية؛ ومع ذلك، تنتج الميتوكوندريا الزائدة أيضا أنواع الأكسجين التفاعلية (روس) التي يمكن أن تتسبب في موت الخلايا. ولذلك، يجب تعديل عدد الميتوكوندريا باستمرار لتناسب احتياجات الخلايا. ويتحقق هذا التنظيم الحيوي في الجزء من خلال وظيفة lysosomes إزالة الفائض/تلف العضيات والجزيئات. ومن ثم، محتويات mitochondrial وتعويض الخلوية مؤشرات أساسية لتقييم التكيف الأيضي للخلايا. مع تطور التحقيقات العضيات، يحلول تتسم جيدا أو الأصباغ الميتوكوندريا على حدة قد أصبحت متاحة في أشكال مختلفة لتسمية lysosomes الخلوية والميتوكوندريا. قياس التدفق متعدد الألوان هي أداة مشتركة لتعمل الخلية الشخصية، ولديها القدرة على أن تكون متكاملة مع فحوصات أخرى. نقدم هنا، على بروتوكول مفصلة لكيفية الجمع بين الأصباغ عضية على حدة مع السطح علامات تلطيخ لقياس مقدار lysosomes والميتوكوندريا في السكان مختلفة تي خلية على سيتوميتير تدفق.
Introduction
التنشيط وتكاثر الخلايا T خطوات حاسمة لتركيب الاستجابات المناعية ناجحة. التقدم الذي أحرز مؤخرا تشير إلى أن الأيض الخلوية يرتبط محكم مع كل من التنمية ووظائف خلايا تي. على سبيل المثال، خلايا السذاجة تي تعتمد إلى حد كبير على الفسفرة (أوكسفوس) لتلبية الطلب على الطاقة خلال تداولها فيما بين الأجهزة اللمفاوية الثانوية. عند التنشيط، الخضوع السذاجة تي خلايا جذرية الأيضية إعادة البرمجة، بما في ذلك تنظيم دورات تعريفية لتحلل الهوائية لزيادة إنتاج ATP والوفاء بمطالب الأيضية هائلة خلال تمايز الخلايا وانتشارها. الخلايا التي لا تتبع من خلال احتياجات الأيضية يموت قبل المبرمج1،2. أثناء إعادة برمجة التمثيل الغذائي، الميتوكوندريا دوراً هاما نظراً لأنهم العضيات مسؤولة إلى حد كبير عن إنتاج ATP إمداد الطاقة للخلية، ومحتوى الميتوكوندريا الخلوية يتقلب أثناء تبديل التمثيل الغذائي في جميع أنحاء تي خلية التنمية والتنشيط3. ومع ذلك، يمكن أن تنتج تراكم الميتوكوندريا زائدة عن الحاجة أو التالفة روس الزائدة التي تضر الدهون والبروتينات والحمض النووي، ويمكن أن تؤدي في نهاية المطاف إلى الخلية الموت4
تتم إزالة الميتوكوندريا المفرطة أو التالفة الناتجة عن التغيرات الاستقلابية بشكل متخصصة من أوتوفاجي5، المعروفة باسم ميتوفاجي. الميتوكوندريا هي ملفوفة أوتوفاجوسوميس وتنصهر ثم مع lysosomes للتدهور. إغلاق هذه الاتصالات بين الميتوكوندريا و lysosomes أثارت اهتمام كبير6،7. على سبيل المثال، يحفز الأكسدة الميتوكوندريا شكل حويصلات المستمدة من الميتوكوندريا (مدفس) التي تستهدف lysosomes للتدهور في homolog الفوسفاتيز وتنزين (فتن)-التي يسببها كيناز المفترضة 1 (PINK1) وباركين (E3 ubiquitin ليجاسى) تعتمد طريقة8. ووجد أيضا أن ميتوفاجي أمر ضروري للانتقال adipocyte بيج إلى الأبيض9،10. الأهم من ذلك، ليسوسوميس ليست مجرد حجرة تدهور، ولكن أيضا منظم للإشارات الخلوية. تراكم الركازة المفرطة الناجمة عن نقص إنزيم ينتج خلل الليزوزومية بتعطيل نفاذية غشاء الليزوزومية ويؤثر على Ca2 + التوازن11. خلية T العيوب الفنية في lipase حمض الليزوزومية (ال)12 أو المستقلب الليزوزومية الناقل خروج المغلوب الماوس نموذج13 كما أظهرت أهمية lysosomes في الحفاظ على التوازن خلية تي. الميتوكوندريا و lysosomes جزء لا يتجزأ من تنظيم الأيض الخلوية. ولذلك كان قياس محتوى المتقدرية الخلوية هي مؤشر حاسم لتقييم وضع الخلية تي الأيضية والوظيفية.
وتشمل فحوصات استخداماً لقياس محتويات المتقدرية أو الليزوزومية الخلوية immunoblot والمجهر الإلكتروني وتلطيخ (إذا كان) إيمونوفلوريسسينت وتحليل PCR mitochondrial DNA نسخ الأرقام14،15، 16. بينما يمكن مقارنة immunoblot كمياً مستويات البروتين عبر عينات مختلفة والالكترون، أو إذا كان الفحص المجهري يمكن أن تصور المورفولوجية السمات المميزة لهذه العضيات17، هذه فحوصات تحمل بعض العيوب التقنية. على سبيل المثال، أنها تستغرق وقتاً طويلاً للحصول على عدد كاف من الصور خلية مع تضخم عالية والقرار أو لمقارنة مستويات البروتين التعبير عبر العشرات من عينات، مما يجعل هذه الاختبارات تعتبر أساليب إنتاجية منخفضة. وعلاوة على ذلك، يمكن تطبيق هذه الاختبارات فقط للسكان خلية متجانسة، مثل خطوط الخلية، ولكن ليس لعينات الأنسجة التي تتكون من السكان مختلطة.
من الصعب أيضا أن تطبيق هذه الاختبارات على السكان النادرة، التي أرقام شرط الحد الأدنى من خلية من 106 إلى 108 من المستحيل أن تجتمع. وأخيراً، عادة تفكيك الخلايا أو ثابتة أثناء العملية، وجعلها متوافقة مع أساليب أخرى لاستخراج مزيد من المعلومات. مقارنة بالطرق التقليدية، قد فلوري-على أساس التدفق الخلوي إنتاجية عالية نسبيا-يمكن تحليل المعلومات من كافة الخلايا داخل عينة مؤلفة من الخلايا المختلطة السكان والتي جمعت في وقت واحد. وبالإضافة إلى ذلك، يمكن للمرء الكشف عن أكثر من 10 معلمات في نفس الخلية وفرز الخلايا استناداً إلى تعمل المطلوب لفحوصات إضافية. وقد استخدمت لتسمية lysosomes والميتوكوندريا في الخلايا الحية المسابير الفلورسنت رد الفعل ويمكن الكشف عنها بواسطة التدفق الخلوي18،19. هذه المجسات الخاصة عضية الخلية نفاذية والخصائص الفيزيائية-الكيميائية التي تسمح لهم بأن تتركز في أماكن محددة سوبسيلولار أو العضيات. مريح، تتوفر هذه التحقيقات في مختلف صيغ الفلورسنت، مما يمكن تطبيقها لتحليل متعدد الألوان.
هذا البروتوكول ويصف بالتفصيل كيفية الجمع بين سطح علامة التلوين بالأصباغ يحلول أو الميتوكوندريا محددة لتسمية lysosomes أو يعيش الميتوكوندريا في الخلايا. وهذا مفيد بشكل خاص لعينات المتولدة من الابتدائي الأنسجة والأعضاء، التي تتكون غالباً من سكان الخلية غير متجانسة. يمكن تحديد السكان خلية من اهتمام بتعبيرها ماركر السطحية الباحثين وعلى وجه التحديد قياس محتويات الليزوزومية أو الميتوكوندريا عن طريق الأصباغ عضية على حدة في هذه الخلايا. هنا، علينا أن نظهر الإجراءات المفصلة لتحليل تدفق سيتوميتريك أن يقيم كتلة الليزوزومية أو الميتوكوندريا في الجمهرات الفرعية الرئيسية الخلية تي الطحال.
Protocol
Representative Results
Discussion
يجمع هذا البروتوكول الأصباغ عضية على حدة وعلامة السطحية تلطيخ لتحديد مقدار الميتوكوندريا أو ليسوسوميس في السكان مختلفة تي الخلية. تم تطوير هذا الأسلوب للتغلب على الحد متطلبات الخلية عدد والتجانس للأساليب التقليدية، مثل الميكروسكوب الإلكتروني وتحليل إيمونوبلوت. أنها مفيدة بشكل خاص في ت?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
وأيد وضع هذا البروتوكول المنح التي تقدمها “تايوان وزارة العلوم” والتكنولوجيا (معظم) NSC103-2320-B-010-002-MY2 و MOST104-2628-B-010-002-MY4 إلى هسو البنود. وي C.W. مستلم “ممتازة أطروحة جائزة من معهد لعلم الأحياء الدقيقة” وعلم المناعة، جامعة يانغ مينغ الوطنية.
Materials
| 10 cm Graefe forceps (straight and serrated) | Dimeda | ||
| 11 cm Iris scissors (straight with sharp/sharp heads) | Dimeda | ||
| 15 mL centrifuge tube | Thermo Fisher Scientific | 339650 | |
| 5 mL syringe | TERUMO | ||
| 6 cm Petri dish | α-plus | ||
| 70 µm nylon cell strainer | SPL Lifesciences | 93070 | |
| Ammonium chloride (NH4Cl) | Sigma | A9434 | |
| Anti-mouse CD25 | Biolegend | 102007 | Clone:PC61 |
| Anti-mouse CD4 | Biolegend | 100453 | Clone:GK1.5 |
| Anti-mouse CD44 | Biolegend | 103029 | Clone:IM7 |
| Anti-mouse CD62L | Biolegend | 104407 | Clone:MEL-14 |
| Anti-mouse CD8 | Biolegend | 100713 | Clone:53-6.7 |
| Anti-mouse TCRβ | Biolegend | 109233 | Clone:H57-579 |
| BD LSRFortessa | BD Biosciences | ||
| Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) | Bio basic | 6381-92-6 | |
| FALCON 5ml Polystyrene Round-Bottom Tube (FACS tube) | BD Biosciences | 352052 | |
| FcRgamma II (CD32) Hybridoma (2.4G2) | ATCC | HB-197 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Hyclone | ATD161145 | |
| Flowjo, LLC | BD Biosciences | ||
| Hydroxyethyl piperazineethanesulfonic acid (HEPES) | Sigma | H4034 | |
| L-glutamine (200 mM) | Gibco | A2916801 | |
| LysoTracker Green DND26 | Thermo Fisher Scientific | L7526 | |
| MEM Non-essential amino acids (100X) | Gibco | 11140050 | |
| MitoTracker Green FM | Thermo Fisher Scientific | M7514 | |
| Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) | Gibco | 15140122 | |
| Potassium bicarbonate (KHCO3) | J.T.baker | 298-14-6 | |
| Propidium iodide solution | Sigma | 25535-16-4 | |
| RPMI 1640 medium (powder) | Gibco | 31800089 | |
| Sodium bicarbonate (NaHCO3) | Sigma | S5761 | |
| Sodium pyruvate (100 mM) | Gibco | 11360070 |
References
- Buck, M. D., O’Sullivan, D., Pearce, E. L. T cell metabolism drives immunity. Journal of Experimental Medicine. 212 (9), 1345-1360 (2015).
- Marelli-Berg, F. M., Fu, H., Mauro, C. Molecular mechanisms of metabolic reprogramming in proliferating cells: implications for T-cell-mediated immunity. Immunology. 136 (4), 363-369 (2012).
- Pua, H. H., Guo, J., Komatsu, M., He, Y. W. Autophagy is essential for mitochondrial clearance in mature T lymphocytes. The Journal of Immunology. 182 (7), 4046-4055 (2009).
- Chao, T., Wang, H., Ho, P. C. Mitochondrial Control and Guidance of Cellular Activities of T Cells. Frontiers in Immunology. 8, 473 (2017).
- Youle, R. J., Narendra, D. P. Mechanisms of mitophagy. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 12 (1), 9-14 (2011).
- Diogo, C. V., Yambire, K. F., Fernández Mosquera, L., Branco, F. T., Raimundo, N. Mitochondrial adventures at the organelle society. Biochemical and Biophysical Research Communications. 500 (1), 87-93 (2018).
- Todkar, K., Ilamathi, H. S., Germain, M. Mitochondria and Lysosomes: Discovering Bonds. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 5, 106 (2017).
- McLelland, G. L., Soubannier, V., Chen, C. X., McBride, H. M., Fon, E. A. Parkin and PINK1 function in a vesicular trafficking pathway regulating mitochondrial quality control. The EMBO Journal. 33 (4), 282 (2014).
- Wrighton, K. H. Metabolism: Mitophagy turns beige adipocytes white. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 17 (10), 607 (2016).
- Altshuler-Keylin, S., et al. Beige Adipocyte Maintenance Is Regulated by Autophagy-Induced Mitochondrial Clearance. Cell Metabolism. 24 (3), 402-419 (2016).
- Settembre, C., Fraldi, A., Medina, D. L., Ballabio, A. Signals from the lysosome: a control centre for cellular clearance and energy metabolism. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 14 (5), 283-296 (2013).
- Qu, P., Du, H., Wilkes, D. S., Yan, C. Critical roles of lysosomal acid lipase in T cell development and function. The American Journal of Pathology. 174 (3), 944-956 (2009).
- Wei, C. W., et al. Equilibrative Nucleoside Transporter 3 Regulates T Cell Homeostasis by Coordinating Lysosomal Function with Nucleoside Availability. Cell Reports. 23 (8), 2330-2341 (2018).
- Baixauli, F., et al. Mitochondrial Respiration Controls Lysosomal Function during Inflammatory T Cell Responses. Cell Metabolism. 22 (3), 485-498 (2015).
- Piantadosi, C. A., Suliman, H. B. Mitochondrial transcription factor A induction by redox activation of nuclear respiratory factor 1. The Journal of Biological Chemistry. 281 (1), 324-333 (2006).
- Zhu, Y., et al. Constitutive association of the proapoptotic protein Bim with Bcl-2-related proteins on mitochondria in T cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101 (20), 7681-7686 (2004).
- Ding, W. X., Yin, X. M. Mitophagy: mechanisms, pathophysiological roles, and analysis. Biological Chemistry. 393 (7), 547-564 (2012).
- van der Windt, G. J. W., et al. CD8 memory T cells have a bioenergetic advantage that underlies their rapid recall ability. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (35), 14336 (2013).
- Chikte, S., Panchal, N., Warnes, G. Use of Lyso dyes: A flow cytometric study of autophagy. Cytometry Part A. 85 (2), 169-178 (2013).
- Allan, A. L., Keeney, M. Circulating tumor cell analysis: technical and statistical considerations for application to the clinic. Journal of Oncology. 2010, 426218 (2010).
- Curtsinger, J. M., Lins, D. C., Johnson, C. M., Mescher, M. F. Signal 3 tolerant CD8 T cells degranulate in response to antigen but lack granzyme B to mediate cytolysis. The Journal of Immunology. 175 (7), 4392-4399 (2005).
- Wolint, P., Betts, M. R., Koup, R. A., Oxenius, A. Immediate cytotoxicity but not degranulation distinguishes effector and memory subsets of CD8+ T cells. Journal of Experimental Medicine. 199 (7), 925-936 (2004).
- Van den Bossche, J., et al. Mitochondrial Dysfunction Prevents Repolarization of Inflammatory Macrophages. Cell Reports. 17 (3), 684-696 (2016).
- Pearce, E. J., Everts, B. Dendritic cell metabolism. Nature Reviews Immunology. 15 (1), 18-29 (2015).
- Dugnani, E., et al. Integrating T cell metabolism in cancer immunotherapy. Cancer Letters. 411, 12-18 (2017).
- Yang, Z., Matteson, E. L., Goronzy, J. J., Weyand, C. M. T-cell metabolism in autoimmune disease. Arthritis Research & Therapy. 17 (1), 29 (2015).
