استخدام المحتوى العالي من التصوير لقياس الهدف المشاركة في خلايا ملتصقة
Summary
قياسات للمخدرات هدف المشاركة أمران أساسيان لتطوير العقاقير الفعالة والتحقق من صحة التحقيق الكيميائية. هنا، نحن تفاصيل بروتوكول لقياس الاشتباك المخدرات المستهدفة باستخدام التصوير عالية المحتوى في تكييف الميكروسكوبية المتوافقة المقايسة الخلوية التحول الحراري (سيتسا).
Abstract
كوانتيتاتينج تفاعل الجزيئات الصغيرة مع الهدف المقصود من البروتين أمر بالغ الأهمية لتطوير العقاقير والتحقق من صحة الهدف والتحقق من صحة التحقيق الكيميائية. أساليب قياس هذه الظاهرة دون تعديل الهدف بروتين أو جزيء صغير قيمة خاصة ولو من الناحية التقنية الصعبة. المقايسة الخلوية التحول الحراري (سيتسا) أسلوب واحد لرصد المشاركة المستهدفة في الخلايا الحية. وهنا يصف لنا تعديلاً للبروتوكول سيتسا الأصلي، والذي يسمح لقياسات عالية الإنتاجية مع احتفاظها بالتعريب سوبسيلولار على مستوى الخلية الواحدة. ونحن نعتقد أن هذا البروتوكول يوفر تقدما هاما لتطبيق سيتسا لتوصيف متعمقة للتفاعل المجمع المستهدف، لا سيما في السكان غير متجانسة من الخلايا.
Introduction
عند تطوير عقاقير جديدة أو المجسات الكيميائية من الضروري للزوجين التأثير الدوائي الملاحظ أو قراءات وظيفية للقياسات لشغل المستهدفة أو المشاركة في الخلايا الحية1،،من23. هذه البيانات ضرورية للتأكد من أن الجزيئات الصغيرة في الواقع تصل إلى هدفها المنشود، وكذلك للتحقق من صحة الفرضية البيولوجية وراء البروتين المستهدف التحديد4،5. وعلاوة على ذلك، وأثناء تطوير الأدوية، تستخدم نظم نموذجية للتعقيد المتزايد تحديد وتأكيد رائد مركبة قبل التجارب السريرية. لتأكيد الترجمة البيولوجيا عبر هذه النظم الإكلينيكية، أساليب لاقتفاء أثر المخدرات-هدف المشاركة والمصاحبة لعلم الأحياء في جميع مراحل عملية التنمية هذه الحاسمة.
مشاركة المخدرات المستهدفة تقليديا تحديا لرصد في الخلايا الحية مع جزيئات صغيرة أونفونكتيوناليزيد والبروتينات، وبخاصة على مستوى خلية واحدة مع القرار المكانية6،7. أسلوب واحد مؤخرا لمراقبة التفاعل بين معدلة العقاقير والبروتينات في الخلايا الحية هي المقايسة الخلوية التحول الحراري (سيتسا) الذي هو استقرار البروتين الأصلي في الاستجابة لتحدي حرارة المستحثة يجند كمياً8، 9،10. يتم ذلك عن طريق تحديد كمية البروتين للذوبان المتبقية بعد التعرض لحرارة تحد. في الكشف عن أولى سيتسا، استخدمت لطخة غربية للكشف. لتمكين حملات الفحص وضرب فرز مجموعات أكبر مجمع، الجهود المبذولة لزيادة إنتاجية تجارب سيتسا قد تؤدي إلى تطوير عدة فحوصات متجانسة، وعلى أساس ميكروسكوبية10،11. ومع ذلك، هو القيد واحد مع هذه الأساليب حاليا أفضل فإنها تكون مناسبة للعلاج المركب في تعليق خلية ويتطلب الكشف عن تحلل الخلية، مما يؤدي إلى فقدان المعلومات المكانية. سيتسا يمكن تطبيقها تجريبيا أما إلى تحول المستحثة يجند في التجميع الحراري درجة الحرارة (Tagg) في تركيز واحد من جزيء صغير أو تركيز يجند اللازمة لتحقيق الاستقرار في البروتين عند درجة حرارة واحدة. هذا الأخير هو ما يسمى الجرعة متحاور استجابة بصمات الأصابع (إيتدرف) للدلالة على الاعتماد على هذه القياسات في ظروف تجريبية محددة.
والهدف من هذا البروتوكول قياس الاشتباك المستهدفة باستخدام سيتسا في الخلايا ملتصقة بكشف الأجسام المضادة (إذا كان) إيممونوفلوريسسينت مع ارتفاع محتوى الفحص المجهري12. ويمتد هذا الإجراء منصة سيتسا الأصلي للسماح لخلية واحدة القياس الكمي لمشاركة الهدف مع الحفاظ على الترجمة سوبسيلولار. جدير بالذكر أن خلافا للعديد من التقارير السابقة، في هذا الإجراء العلاج المركب يتم في الخلايا ملتصقة العيش دون مفرزة السطحية أو الغسيل قبل التحدي الحرارة، وبالتالي الحفاظ على توازن المنشأة ملزمة ونحن نهدف إلى قياس13. حاليا، يتم التحقق من الأسلوب لهدف واحد بروتين p38α (MAPK14) في الخلية عدة خطوط، ويحدونا الأمل في أن تقاسم هذا الإجراء هذه التقنية يمكن تطبيقها على نطاق واسع عبر البروتين ذوبان. ونحن نتوقع أن هذا البروتوكول يمكن تكييفها في جميع أنحاء خط الأنابيب التنمية المخدرات من الفحص، وضرب التعقب عن طريق رصد الهدف المشاركة في فيفو.
Protocol
Representative Results
Discussion
كما تمت مناقشته في المقطع النتائج، هناك العديد من الخطوات الرئيسية لهذا الإجراء. أولاً، من المهم التعرف كاشف تقارب عالية الجودة. نوصي بفحص مكتبة صغيرة من الأجسام المضادة لكل من الهدف المنشود. بعد أن تم تحديد جسم الأولية، من المهم أيضا التحقق من صحة النظام لعدد من المواقع المختلفة ملزمة ال?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
الكتاب تقر دعم البنية التحتية من علوم الحياة مختبر ومعهد كارولينسكا. كما تقر المؤلفين الإدخال ومناقشات مع شهادتي ميكايلا، ماغدالينا أوتروكا وتوماس Lundbäck.
Materials
| Phosphate-buffered saline (PBS) | Medicago | 09-9400-100 | |
| TrypLE Express | ThermoFisher Scientific | 12604013 | for detaching cells and subculturing |
| 16% paraformaldehyde (PFA) | ThermoFisher Scientific | 28908 | fixative |
| Goat anti-rabbit IgG (H+L), Alexa Fluor 488 conjugated antibody | ThermoFisher Scientific | A11008 | secondary antibody |
| HCS CellMask Red stain | ThermoFisher Scientific | H32712 | Cytoplasm stain |
| NP-40 | Sigma-Aldrich | 56741 | for permeabilization |
| Hoechst stain 33342 | Sigma-Aldrich | B2261 | nuclear stain |
| Dulbecco’s modified Eagle’s medium (DMEM) – high Glucose | Sigma-Aldrich | 6429 | cell culture media component |
| Heat-inactivated fetal bovine serum (FBS) | Sigma-Aldrich | F9665 | cell culture media component |
| Penicillin-Streptomycin | Sigma-Aldrich | P4333 | cell culture media component |
| Corning, breathable plate seal | Sigma-Aldrich | CLS3345 | for copound incubation step |
| Rabbit anti-p38 antibody [E229] | Abcam | ab170099 | primary antibody, LOT:GR305364-16 |
| Falcon, Black 384-well clear bottom imaging plates | VWR | 736-2044 | imaging plates |
| Greiner, 384-well low volume polypropylene plates | VWR | 784201 | |
| Adhesive aluminum foil | VWR | 30127790 | |
| Peelable aluminium seal | Agilent | 24210-001 | for PlateLoc |
| LY2228820 | Selleckchem | S1494 | p38α inhibitor |
| PH797804 | Selleckchem | PH797804 | p38α inhibitor |
| BIRB796 | Selleckchem | S1574 | p38α inhibitor |
| SB203580 | Tocris | 1202 | p38α inhibitor |
| AMG 548 | Tocris | 3920 | p38α inhibitor |
| RWJ 67657 | Tocris | 2999 | p38α inhibitor |
| L-Skepinone | CBCS compound collection | p38α inhibitor | |
| Bovine serum albumin (BSA) | Sigma-Aldrich | A7030 | blocking agent |
| SDS (sodium dodecyl sulfate) | BDH | 44244 | used in antigen retrieval |
| Glycine | Sigma-Aldrich | G8898 | used in antigen retrieval |
| A-431 cells | ATCC | ATC-CRL-1555 | |
| Echo 550 | Labcyte | For preparation of compound plates | |
| Plate sealer | Agilent | PlateLoc | |
| Bulk reagent dispenser | Thermo Scientific | 5840300 | Multidrop Combi |
| Automated liquid handling | Agilent | Bravo liquid handling platform; used for compound plate preparation | |
| Plate washer | Tecan | Hydrospeed | |
| Water bath | Julabo | TW12 | |
| Thermocouple | VWR | Thermocouple traceable lab thermometer | |
| High content imager | Molecular Devices | ImageXpress Micro XLS Widefield High-Content Analysis System |
References
- Morgan, P., et al. Impact of a five-dimensional framework on R&D productivity at AstraZeneca. Nature Reviews Drug Discovery. 17 (3), 167-181 (2018).
- Freedman, L. P., Cockburn, I. M., Simcoe, T. S. The Economics of Reproducibility in Preclinical Research. PLOS Biology. 13 (6), e1002165 (2015).
- Waring, M. J., et al. An analysis of the attrition of drug candidates from four major pharmaceutical companies. Nature Reviews Drug Discovery. 14 (7), 475-486 (2015).
- Morgan, P., et al. Can the flow of medicines be improved? Fundamental pharmacokinetic and pharmacological principles toward improving Phase II survival. Drug Discovery Today. 17 (9), 419-424 (2012).
- Bunnage, M. E., Chekler, E. L. P., Jones, L. H. Target validation using chemical probes. Nature Chemical Biology. 9 (4), 195-199 (2013).
- Schürmann, M., Janning, P., Ziegler, S., Waldmann, H. Small-Molecule Target Engagement in Cells. Cell Chemical Biology. 23 (4), 435-441 (2016).
- Robers, M. B., et al. Target engagement and drug residence time can be observed in living cells with BRET. Nature Communications. 6, 10091 (2015).
- Martinez Molina, D., et al. Monitoring drug target engagement in cells and tissues using the cellular thermal shift assay. Science. 341 (6141), 84-87 (2013).
- Martinez Molina, D., Nordlund, P. The Cellular Thermal Shift Assay: A Novel Biophysical Assay for In situ Drug Target Engagement and Mechanistic Biomarker Studies. Annual Review of Pharmacology and Toxicology. 56, 141-161 (2016).
- Jafari, R., et al. The cellular thermal shift assay for evaluating drug target interactions in cells. Nature Protocols. 9 (9), 2100-2122 (2014).
- Almqvist, H., et al. CETSA screening identifies known and novel thymidylate synthase inhibitors and slow intracellular activation of 5-fluorouracil. Nature Communications. 7, 11040 (2016).
- Axelsson, H., et al. In situ Target Engagement Studies in Adherent Cells. ACS Chemical Biology. 13 (4), 942-950 (2018).
- Seashore-Ludlow, B., Perspective Lundbäck, T. E. a. r. l. y. Microplate Application of the Cellular Thermal Shift Assay (CETSA). Journal of Biomolecular Screening. 21 (10), 1019-1033 (2016).
- Axelsson, H., Almqvist, H., Seashore-Ludlow, B., Lundback, T., Sittampalam, G. S., et al. . Assay Guidance Manual [Internet]. , (2016).
- Mateus, A., et al. Prediction of intracellular exposure bridges the gap between target- and cell-based drug discovery. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 114 (30), E6231-E6239 (2017).
