Con alto contenido de imagen para cuantificar la participación de blanco en las células adherentes
Summary
Medidas del contrato de blanco de la droga son fundamentales para desarrollo de fármacos eficaces y validación química de la sonda. Aquí detallamos un protocolo para la medición de compromiso de Diana farmacológica con alta proyección de imagen contenido en una adaptación de microplacas compatibles del ensayo celular cambio térmico (CETSA).
Abstract
Cuantificación de la interacción de moléculas pequeñas con su blanco prevista de la proteína es fundamental para desarrollo de fármacos, validación de destino y validación química de la sonda. Métodos que miden este fenómeno sin modificación del destino de la proteína o molécula pequeña son particularmente valiosos aunque técnicamente difícil. El ensayo celular cambio térmico (CETSA) es una técnica para supervisar el contrato de blanco en las células vivas. Aquí, describimos una adaptación del protocolo original de CETSA, que permite mediciones de alto rendimiento manteniendo la localización subcelular en el nivel unicelular. Creemos que este protocolo ofrece importantes avances para la aplicación de CETSA profunda caracterización del compuesto objetivo interacción, especialmente en poblaciones heterogéneas de células.
Introduction
En el desarrollo de nuevos fármacos o sondas químicas es esencial par el efecto farmacológico observado o lectura funcional a las medidas de ocupación del destino o participación en células vivas1,2,3. Estos datos son necesarios para que la molécula pequeña de hecho llegue a su destino deseado y validar la hipótesis biológica detrás de proteína objetivo selección4,5. Además, durante el desarrollo de drogas, modelo de los sistemas de complejidad creciente se utiliza para seleccionar y corroborar un plomo compuesto antes de los ensayos clínicos. Para confirmar la traducción de la biología a través de estos sistemas preclínicos, métodos de rastreo contrato de drogas blanco y acompañando la biología a lo largo de este proceso de desarrollo son fundamentales.
Compromiso de Diana farmacológica ha sido tradicionalmente difícil de controlar en células vivas con unfunctionalized pequeñas moléculas y proteínas, especialmente a nivel unicelular con resolución espacial6,7. Sin modificar de un método reciente para observar la interacción entre fármacos y proteínas en células vivas es el ensayo celular cambio térmico (CETSA) en el cual estabilización inducida por ligando de una proteína nativa en respuesta a un desafío de calor es cuantificada8, 9,10. Esto se logra mediante la cuantificación de proteína soluble restante después de la exposición a un desafío de calor. En la divulgación inicial de CETSA, mancha blanca /negra occidental fue utilizada para la detección. Para activar campañas de detección y clasificación de colecciones compuestos más grandes del golpe, los esfuerzos para aumentar el rendimiento de CETSA experimentos han llevado al desarrollo de varios ensayos homogéneos, basado en una microplaca10,11. Sin embargo, una limitación con estos métodos es que ellos son actualmente más adecuados para tratamiento compuesto en suspensiones celulares y lisis celular, llevando a la pérdida de la información espacial requiere de la detección. CETSA puede ser aplicado experimentalmente como un cambio inducido por ligando de temperatura térmica agregación (Tagg) en una concentración única de la molécula pequeña o la concentración del ligand necesaria para estabilizar la proteína en una sola temperatura. Este último se denomina huellas dactilares isotermo dosis respuesta (ITDRF) para indicar la dependencia de estas mediciones en las condiciones experimentales específicas.
El objetivo de este protocolo es medir el compromiso de destino mediante CETSA en células adherentes detección inmunofluorescente del anticuerpo de (IF) con microscopía de alto contenido12. Este procedimiento extiende la plataforma original de CETSA para permitir la cuantificación unicelular del contrato de blanco con la conservación de la localización subcelular. En particular, a diferencia de muchos informes anteriores, en este procedimiento de tratamiento compuesto se realiza en células vivas adherentes sin desprendimiento superficial o lavado antes del reto de calor, preservando así el equilibrio establecido enlace que pretendemos medir13. Actualmente, el método está validado para un destino proteína p38α (MAPK14) en varias líneas celulares, y esperamos que al compartir este procedimiento la técnica se puede aplicar ampliamente a través del fusión proteoma. Esperamos que este protocolo puede ser adaptado a lo largo de la tubería del desarrollo drogas de proyección, golpe clasificación a través de seguimiento de objetivo participación en vivo.
Protocol
Representative Results
Discussion
Como comentamos en la sección de resultados, hay varias medidas claves para el procedimiento. En primer lugar, es importante identificar un reactivo de alta calidad afinidad. Recomendamos una pequeña biblioteca de anticuerpos para cada objetivo deseado de detección. Después de que un anticuerpo primario se ha seleccionado, también es importante validar el sistema para un número de sitios de Unión diferentes de la meta de proteína si es necesario. Counter-detección de compuestos que interfieren con la señal de e…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Los autores reconocen el apoyo de infraestructura de ciencia para laboratorio de la vida y el Karolinska Institutet. Los autores también reconocen entrada y discusiones con Michaela Vallin, Magdalena Otrocka y Thomas Lundbäck.
Materials
| Phosphate-buffered saline (PBS) | Medicago | 09-9400-100 | |
| TrypLE Express | ThermoFisher Scientific | 12604013 | for detaching cells and subculturing |
| 16% paraformaldehyde (PFA) | ThermoFisher Scientific | 28908 | fixative |
| Goat anti-rabbit IgG (H+L), Alexa Fluor 488 conjugated antibody | ThermoFisher Scientific | A11008 | secondary antibody |
| HCS CellMask Red stain | ThermoFisher Scientific | H32712 | Cytoplasm stain |
| NP-40 | Sigma-Aldrich | 56741 | for permeabilization |
| Hoechst stain 33342 | Sigma-Aldrich | B2261 | nuclear stain |
| Dulbecco’s modified Eagle’s medium (DMEM) – high Glucose | Sigma-Aldrich | 6429 | cell culture media component |
| Heat-inactivated fetal bovine serum (FBS) | Sigma-Aldrich | F9665 | cell culture media component |
| Penicillin-Streptomycin | Sigma-Aldrich | P4333 | cell culture media component |
| Corning, breathable plate seal | Sigma-Aldrich | CLS3345 | for copound incubation step |
| Rabbit anti-p38 antibody [E229] | Abcam | ab170099 | primary antibody, LOT:GR305364-16 |
| Falcon, Black 384-well clear bottom imaging plates | VWR | 736-2044 | imaging plates |
| Greiner, 384-well low volume polypropylene plates | VWR | 784201 | |
| Adhesive aluminum foil | VWR | 30127790 | |
| Peelable aluminium seal | Agilent | 24210-001 | for PlateLoc |
| LY2228820 | Selleckchem | S1494 | p38α inhibitor |
| PH797804 | Selleckchem | PH797804 | p38α inhibitor |
| BIRB796 | Selleckchem | S1574 | p38α inhibitor |
| SB203580 | Tocris | 1202 | p38α inhibitor |
| AMG 548 | Tocris | 3920 | p38α inhibitor |
| RWJ 67657 | Tocris | 2999 | p38α inhibitor |
| L-Skepinone | CBCS compound collection | p38α inhibitor | |
| Bovine serum albumin (BSA) | Sigma-Aldrich | A7030 | blocking agent |
| SDS (sodium dodecyl sulfate) | BDH | 44244 | used in antigen retrieval |
| Glycine | Sigma-Aldrich | G8898 | used in antigen retrieval |
| A-431 cells | ATCC | ATC-CRL-1555 | |
| Echo 550 | Labcyte | For preparation of compound plates | |
| Plate sealer | Agilent | PlateLoc | |
| Bulk reagent dispenser | Thermo Scientific | 5840300 | Multidrop Combi |
| Automated liquid handling | Agilent | Bravo liquid handling platform; used for compound plate preparation | |
| Plate washer | Tecan | Hydrospeed | |
| Water bath | Julabo | TW12 | |
| Thermocouple | VWR | Thermocouple traceable lab thermometer | |
| High content imager | Molecular Devices | ImageXpress Micro XLS Widefield High-Content Analysis System |
References
- Morgan, P., et al. Impact of a five-dimensional framework on R&D productivity at AstraZeneca. Nature Reviews Drug Discovery. 17 (3), 167-181 (2018).
- Freedman, L. P., Cockburn, I. M., Simcoe, T. S. The Economics of Reproducibility in Preclinical Research. PLOS Biology. 13 (6), e1002165 (2015).
- Waring, M. J., et al. An analysis of the attrition of drug candidates from four major pharmaceutical companies. Nature Reviews Drug Discovery. 14 (7), 475-486 (2015).
- Morgan, P., et al. Can the flow of medicines be improved? Fundamental pharmacokinetic and pharmacological principles toward improving Phase II survival. Drug Discovery Today. 17 (9), 419-424 (2012).
- Bunnage, M. E., Chekler, E. L. P., Jones, L. H. Target validation using chemical probes. Nature Chemical Biology. 9 (4), 195-199 (2013).
- Schürmann, M., Janning, P., Ziegler, S., Waldmann, H. Small-Molecule Target Engagement in Cells. Cell Chemical Biology. 23 (4), 435-441 (2016).
- Robers, M. B., et al. Target engagement and drug residence time can be observed in living cells with BRET. Nature Communications. 6, 10091 (2015).
- Martinez Molina, D., et al. Monitoring drug target engagement in cells and tissues using the cellular thermal shift assay. Science. 341 (6141), 84-87 (2013).
- Martinez Molina, D., Nordlund, P. The Cellular Thermal Shift Assay: A Novel Biophysical Assay for In situ Drug Target Engagement and Mechanistic Biomarker Studies. Annual Review of Pharmacology and Toxicology. 56, 141-161 (2016).
- Jafari, R., et al. The cellular thermal shift assay for evaluating drug target interactions in cells. Nature Protocols. 9 (9), 2100-2122 (2014).
- Almqvist, H., et al. CETSA screening identifies known and novel thymidylate synthase inhibitors and slow intracellular activation of 5-fluorouracil. Nature Communications. 7, 11040 (2016).
- Axelsson, H., et al. In situ Target Engagement Studies in Adherent Cells. ACS Chemical Biology. 13 (4), 942-950 (2018).
- Seashore-Ludlow, B., Perspective Lundbäck, T. E. a. r. l. y. Microplate Application of the Cellular Thermal Shift Assay (CETSA). Journal of Biomolecular Screening. 21 (10), 1019-1033 (2016).
- Axelsson, H., Almqvist, H., Seashore-Ludlow, B., Lundback, T., Sittampalam, G. S., et al. . Assay Guidance Manual [Internet]. , (2016).
- Mateus, A., et al. Prediction of intracellular exposure bridges the gap between target- and cell-based drug discovery. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 114 (30), E6231-E6239 (2017).
