Con alto contenuto di Imaging per quantificare l'impegno di destinazione in cellule aderenti
Summary
Misurazioni di aggancio di obiettivo di droga sono centrale per lo sviluppo di farmaci efficaci e convalida di sonda chimica. Qui, dettagliamo un protocollo per la misurazione l’impegno di droga-destinazione usando la formazione immagine contenuta elevata in micropiastra compatibile con l’adattamento del dosaggio cellulare spostamento termico (CETSA).
Abstract
Quantificazione dell’interazione di piccole molecole con loro previsto proteina bersaglio è fondamentale per lo sviluppo di farmaci, destinazione convalida e convalida di sonda chimica. Metodi che misurano questo fenomeno senza modifiche della proteina bersaglio o piccola molecola sono particolarmente preziose, anche se tecnicamente impegnativi. L’analisi di spostamento termico cellulare (CETSA) è una tecnica per monitorare l’impegno di destinazione in cellule viventi. Qui, descriviamo un adattamento del protocollo originale CETSA, che assicura per misurazioni di throughput elevato pur mantenendo la localizzazione subcellulare a livello di singola cellula. Crediamo che questo protocollo offre importanti progressi per l’applicazione di CETSA per approfondita caratterizzazione dell’interazione di composto-destinazione, particolarmente in popolazioni eterogenee delle cellule.
Introduction
Durante lo sviluppo di nuovi farmaci o sonde chimiche è essenziale per accoppiare l’effetto farmacologico osservato o lettura funzionale ad misure di capienza di destinazione o di fidanzamento in cellule vive1,2,3. Tali dati sono necessari per assicurare che la piccola molecola infatti raggiunge la sua destinazione desiderata sia per convalidare l’ipotesi biologica dietro proteine bersaglio selezione4,5. Inoltre, durante lo sviluppo di farmaci, sistemi di modello di complessità crescente vengono utilizzati per selezionare e confermare un piombo composto prima del test clinici. Per confermare la traduzione di biologia attraverso questi sistemi preclinici, metodi per tracciare l’impegno di droga-destinazione e biologia in tutto questo processo di sviluppo di accompagnamento sono critici.
L’impegno di droga-destinazione è tradizionalmente difficile da monitorare in cellule vive con Gegbenenfalls piccole molecole e proteine, soprattutto a livello di singola cellula con risoluzione spaziale6,7. Unmodified risale un metodo per osservare l’interazione tra farmaci e proteine in cellule vive è il test di spostamento termico cellulare (CETSA) in cui stabilizzazione indotta da legante di una proteina nativa in risposta ad una sfida di calore è quantificata8, 9,10. Ciò avviene mediante la quantificazione della proteina solubile rimanente dopo l’esposizione a una sfida di calore. La divulgazione iniziale di CETSA, western blot è stato usato per il rilevamento. Per attivare campagne di screening e colpire triaging delle più grandi collezioni di composti, gli sforzi per aumentare il throughput di CETSA esperimenti hanno portato allo sviluppo di parecchi saggi omogenei, basati su micropiastra10,11. Tuttavia, una limitazione con questi metodi è che attualmente meglio sono adatti al trattamento composto in sospensioni delle cellule e la rilevazione richiede la lisi cellulare, portando alla perdita di informazioni spaziali. CETSA può essere applicato sperimentalmente sia come uno spostamento indotta da legante in temperatura di aggregazione termica (Tagg) ad un’unica concentrazione della molecola piccola o alla concentrazione di ligando necessaria per stabilizzare la proteina ad una singola temperatura. Quest’ultimo è definito le impronte digitali di isotermici dose risposta (ITDRF) per indicare la dipendenza di queste misurazioni specifiche condizioni sperimentali.
L’obiettivo del presente protocollo è quello di misurare l’impegno di destinazione utilizzando CETSA in cellule aderenti di rilevazione dell’anticorpo di immunofluorescenza (IF) con microscopia ad alto contenuto12. Questa procedura si estende la piattaforma CETSA originale per consentire per cella singola quantificazione di aggancio di obiettivo con conservazione della localizzazione subcellulare. In particolare, a differenza di molti rapporti precedenti, in questa procedura composto trattamento viene effettuato in cellule vive aderente senza distacco di superficie o lavaggio prima della sfida di calore, preservando così l’equilibrio stabilito associazione che intendiamo misurare13. Attualmente, il metodo viene convalidato per una destinazione della proteina p38α (MAPK14) in diverse linee cellulari, e ci auguriamo che attraverso la condivisione di questa procedura la tecnica può essere applicata ampiamente attraverso il proteoma di fusione. Prevediamo che questo protocollo può essere adattato in tutta la pipeline di sviluppo di droga dallo screening, ha colpito triaging attraverso al monitoraggio dell’obiettivo fidanzamento in vivo.
Protocol
Representative Results
Discussion
Come discusso nella sezione risultati, ci sono diversi passaggi chiave per la procedura. In primo luogo, è importante identificare un reagente di affinità di alta qualità. Si consiglia una piccola biblioteca di anticorpi per ogni destinazione desiderata di screening. Dopo aver selezionato un anticorpo primario, è anche importante convalidare il sistema per un certo numero di siti leganti differenti della proteina bersaglio, se del caso. Counter-screening per composti che interferiscono con il segnale di test, come mo…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Gli autori riconoscono un’infrastruttura di supporto dalla scienza per il laboratorio di vita e Karolinska Institutet. Gli autori riconoscono anche ingresso e discussioni con Michaela Vallin, Magdalena Otrocka e Thomas Lundbäck.
Materials
| Phosphate-buffered saline (PBS) | Medicago | 09-9400-100 | |
| TrypLE Express | ThermoFisher Scientific | 12604013 | for detaching cells and subculturing |
| 16% paraformaldehyde (PFA) | ThermoFisher Scientific | 28908 | fixative |
| Goat anti-rabbit IgG (H+L), Alexa Fluor 488 conjugated antibody | ThermoFisher Scientific | A11008 | secondary antibody |
| HCS CellMask Red stain | ThermoFisher Scientific | H32712 | Cytoplasm stain |
| NP-40 | Sigma-Aldrich | 56741 | for permeabilization |
| Hoechst stain 33342 | Sigma-Aldrich | B2261 | nuclear stain |
| Dulbecco’s modified Eagle’s medium (DMEM) – high Glucose | Sigma-Aldrich | 6429 | cell culture media component |
| Heat-inactivated fetal bovine serum (FBS) | Sigma-Aldrich | F9665 | cell culture media component |
| Penicillin-Streptomycin | Sigma-Aldrich | P4333 | cell culture media component |
| Corning, breathable plate seal | Sigma-Aldrich | CLS3345 | for copound incubation step |
| Rabbit anti-p38 antibody [E229] | Abcam | ab170099 | primary antibody, LOT:GR305364-16 |
| Falcon, Black 384-well clear bottom imaging plates | VWR | 736-2044 | imaging plates |
| Greiner, 384-well low volume polypropylene plates | VWR | 784201 | |
| Adhesive aluminum foil | VWR | 30127790 | |
| Peelable aluminium seal | Agilent | 24210-001 | for PlateLoc |
| LY2228820 | Selleckchem | S1494 | p38α inhibitor |
| PH797804 | Selleckchem | PH797804 | p38α inhibitor |
| BIRB796 | Selleckchem | S1574 | p38α inhibitor |
| SB203580 | Tocris | 1202 | p38α inhibitor |
| AMG 548 | Tocris | 3920 | p38α inhibitor |
| RWJ 67657 | Tocris | 2999 | p38α inhibitor |
| L-Skepinone | CBCS compound collection | p38α inhibitor | |
| Bovine serum albumin (BSA) | Sigma-Aldrich | A7030 | blocking agent |
| SDS (sodium dodecyl sulfate) | BDH | 44244 | used in antigen retrieval |
| Glycine | Sigma-Aldrich | G8898 | used in antigen retrieval |
| A-431 cells | ATCC | ATC-CRL-1555 | |
| Echo 550 | Labcyte | For preparation of compound plates | |
| Plate sealer | Agilent | PlateLoc | |
| Bulk reagent dispenser | Thermo Scientific | 5840300 | Multidrop Combi |
| Automated liquid handling | Agilent | Bravo liquid handling platform; used for compound plate preparation | |
| Plate washer | Tecan | Hydrospeed | |
| Water bath | Julabo | TW12 | |
| Thermocouple | VWR | Thermocouple traceable lab thermometer | |
| High content imager | Molecular Devices | ImageXpress Micro XLS Widefield High-Content Analysis System |
References
- Morgan, P., et al. Impact of a five-dimensional framework on R&D productivity at AstraZeneca. Nature Reviews Drug Discovery. 17 (3), 167-181 (2018).
- Freedman, L. P., Cockburn, I. M., Simcoe, T. S. The Economics of Reproducibility in Preclinical Research. PLOS Biology. 13 (6), e1002165 (2015).
- Waring, M. J., et al. An analysis of the attrition of drug candidates from four major pharmaceutical companies. Nature Reviews Drug Discovery. 14 (7), 475-486 (2015).
- Morgan, P., et al. Can the flow of medicines be improved? Fundamental pharmacokinetic and pharmacological principles toward improving Phase II survival. Drug Discovery Today. 17 (9), 419-424 (2012).
- Bunnage, M. E., Chekler, E. L. P., Jones, L. H. Target validation using chemical probes. Nature Chemical Biology. 9 (4), 195-199 (2013).
- Schürmann, M., Janning, P., Ziegler, S., Waldmann, H. Small-Molecule Target Engagement in Cells. Cell Chemical Biology. 23 (4), 435-441 (2016).
- Robers, M. B., et al. Target engagement and drug residence time can be observed in living cells with BRET. Nature Communications. 6, 10091 (2015).
- Martinez Molina, D., et al. Monitoring drug target engagement in cells and tissues using the cellular thermal shift assay. Science. 341 (6141), 84-87 (2013).
- Martinez Molina, D., Nordlund, P. The Cellular Thermal Shift Assay: A Novel Biophysical Assay for In situ Drug Target Engagement and Mechanistic Biomarker Studies. Annual Review of Pharmacology and Toxicology. 56, 141-161 (2016).
- Jafari, R., et al. The cellular thermal shift assay for evaluating drug target interactions in cells. Nature Protocols. 9 (9), 2100-2122 (2014).
- Almqvist, H., et al. CETSA screening identifies known and novel thymidylate synthase inhibitors and slow intracellular activation of 5-fluorouracil. Nature Communications. 7, 11040 (2016).
- Axelsson, H., et al. In situ Target Engagement Studies in Adherent Cells. ACS Chemical Biology. 13 (4), 942-950 (2018).
- Seashore-Ludlow, B., Perspective Lundbäck, T. E. a. r. l. y. Microplate Application of the Cellular Thermal Shift Assay (CETSA). Journal of Biomolecular Screening. 21 (10), 1019-1033 (2016).
- Axelsson, H., Almqvist, H., Seashore-Ludlow, B., Lundback, T., Sittampalam, G. S., et al. . Assay Guidance Manual [Internet]. , (2016).
- Mateus, A., et al. Prediction of intracellular exposure bridges the gap between target- and cell-based drug discovery. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 114 (30), E6231-E6239 (2017).
