באמצעות תוכן גבוהה הדמיה לכמת התחייבות היעד תאים חסיד
Summary
מדידות של התרופה היעד אירוסין הן גורם מרכזי פיתוח תרופות יעיל ובדיקת בדיקה כימית. כאן, אנו מפרטים פרוטוקול למדידת סמים-יעד האירוסין באמצעות הדמיה תוכן גבוהה לאגדת microplate תואמי וזמינותו הסלולר shift תרמיים (CETSA).
Abstract
Quantitating את האינטראקציה של מולקולות קטנות עם המטרה חלבון המיועד שלהם הוא קריטי עבור פיתוח תרופות, היעד אימות ובדיקת בדיקה כימית. שיטות למדוד תופעה זו ללא שינוי של חלבון המטרה או מולקולה קטנה הם יקר במיוחד אבל טכנית מאתגר. וזמינותו הסלולר shift תרמיים (CETSA) היא טכניקה אחת לעקוב אחר היעד האירוסין בתאים חיים. כאן, אנו מתארים עיבוד של פרוטוקול CETSA המקורי, אשר מאפשר למדידות תפוקה גבוהה תוך שמירה על לוקליזציה subcellular ברמה תא בודד. אנו מאמינים שפרוטוקול זה מציע מקדמות חשוב ליישום של CETSA עבור אפיון מעמיק של המתחם-יעד אינטראקציה, במיוחד באוכלוסיות הטרוגניות של תאים.
Introduction
בעת פיתוח תרופות חדשות או כימי הגששים חיוני כמה את התצפיות מהדם או פונקציונלי readout למדידות של תפוסת היעד או אירוסין תאים חיים1,2,3. נתונים אלה נחוצים כדי לוודא מולקולה קטנה יגיע למעשה המטרה הרצויה שלו והן כדי לאמת את ההשערה ביולוגי מאחורי חלבון המטרה בחירת4,5. יתר על כן, במהלך פיתוח תרופות, דגם מערכות המורכבות הגוברת משמשים כדי לבחור לאמת חוט המורכב לפני ניסויים קליניים. כדי לאשר תרגום של הביולוגיה על פני המערכות פרה, שיטות איתור סמים-יעד האירוסין וליווי ביולוגיה לאורך כל תהליך הפיתוח זה הם קריטיים.
סמים-יעד האירוסין באופן מסורתי מאתגר כדי לפקח על תאים חיים עם מולקולות קטנות unfunctionalized, חלבונים, במיוחד ברמה תא יחיד עם רזולוציה מרחבית6,7. אחת השיטות האחרונות כדי לבחון האינטראקציה בין יבוצעו בהם שינויים-תרופות, חלבונים בתאים חיים וזמינותו הסלולר shift תרמיים (CETSA) שבו הנוצרות על-ידי ליגנד ייצוב של חלבון יליד בתגובה אתגר חום הוא כימות8, 9,10. זו מושגת על ידי לכימות חלבון מסיס שנותרו לאחר חשיפה אתגר חום. חשיפה ראשונית של CETSA, תספיג שימשה למטרות איתור. כדי לאפשר הקרנה קמפיינים ופגע triaging של אוספים מתחם גדול יותר, המאמצים כדי להגדיל את התפוקה של ניסויים CETSA יש להוביל להתפתחות של מבחני הומוגנית, המבוססים על microplate מספר10,11. עם זאת, מגבלה אחת באמצעות שיטות אלה היא כי הם הם המתאימים ביותר כיום לטיפול המורכב ב השעיות תא האיתור דורש פירוק התא, מוביל לאובדן מידע מרחבי. CETSA יכול להיות מיושם ניסיוניים כמו משמרת הנוצרות על-ידי ליגנד בטמפרטורה צבירת תרמי (Tagg) גם ריכוז אחד של המולקולה קטנה או ריכוז ליגנד לייצב את החלבון בטמפרטורה יחיד. האחרון נקרא במינון איזותרמי התגובה טביעות אצבעות (ITDRF) שמסמלת את התלות של מדידות אלה על תנאי ניסויי ספציפי.
המטרה של פרוטוקול זה היא כדי למדוד את ההתחייבות היעד באמצעות CETSA ב תאים חסיד על ידי זיהוי נוגדנים (אם) immunofluorescent עם מיקרוסקופ גבוהה-תוכן12. הליך זה מרחיב את הפלטפורמה CETSA המקורי כדי לאפשר את החד-תאיים כימות של היעד האירוסין עם שימור לוקליזציה subcellular. ראוי לציין, בניגוד לדיווחים קודמים רבים, בהליך זה מתחם הטיפול מתבצע בתאים חסיד חי ללא ניתוק משטח או כביסה לפני האתגר חום, וכך לשמר את האיזון מחייב הוקמה שאנו שואפים למדוד13. כיום, השיטה מאומתת עבור מטרה אחת חלבון p38α (MAPK14), תא מספר שורות, אנו מקווים כי על-ידי שיתוף הליך זה הטכניקה שניתן להחילה בהרחבה פרוטאום נמס. אנו צופים כי פרוטוקול זה ניתן להתאים לכל אורך הצינור פיתוח התרופה של ההקרנה, פגע triaging דרך כדי ניטור של היעד האירוסין ויוו.
Protocol
Representative Results
Discussion
כפי שפורט בסעיף התוצאות, ישנם מספר שלבים מרכזיים להליך. ראשית, חשוב לזהות ריאגנט זיקה באיכות גבוהה. אנו ממליצים על הקרנת ספרייה קטנה של נוגדנים עבור כל מטרה רצויה. לאחר שנבחר נוגדן ראשוני, חשוב גם לאמת את המערכת עבור מספר אתרי קישור שונים של חלבון היעד במידת הצורך. הקרנה הנגד של תרכובות מפרי…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
המחברים להכיר תשתית תמיכה מן המדע החיים מעבדה קרולינסקה Institutet. המחברים להכיר גם קלט ודיונים עם מיכאלה Vallin, מגדלנה Otrocka, תומאס Lundbäck.
Materials
| Phosphate-buffered saline (PBS) | Medicago | 09-9400-100 | |
| TrypLE Express | ThermoFisher Scientific | 12604013 | for detaching cells and subculturing |
| 16% paraformaldehyde (PFA) | ThermoFisher Scientific | 28908 | fixative |
| Goat anti-rabbit IgG (H+L), Alexa Fluor 488 conjugated antibody | ThermoFisher Scientific | A11008 | secondary antibody |
| HCS CellMask Red stain | ThermoFisher Scientific | H32712 | Cytoplasm stain |
| NP-40 | Sigma-Aldrich | 56741 | for permeabilization |
| Hoechst stain 33342 | Sigma-Aldrich | B2261 | nuclear stain |
| Dulbecco’s modified Eagle’s medium (DMEM) – high Glucose | Sigma-Aldrich | 6429 | cell culture media component |
| Heat-inactivated fetal bovine serum (FBS) | Sigma-Aldrich | F9665 | cell culture media component |
| Penicillin-Streptomycin | Sigma-Aldrich | P4333 | cell culture media component |
| Corning, breathable plate seal | Sigma-Aldrich | CLS3345 | for copound incubation step |
| Rabbit anti-p38 antibody [E229] | Abcam | ab170099 | primary antibody, LOT:GR305364-16 |
| Falcon, Black 384-well clear bottom imaging plates | VWR | 736-2044 | imaging plates |
| Greiner, 384-well low volume polypropylene plates | VWR | 784201 | |
| Adhesive aluminum foil | VWR | 30127790 | |
| Peelable aluminium seal | Agilent | 24210-001 | for PlateLoc |
| LY2228820 | Selleckchem | S1494 | p38α inhibitor |
| PH797804 | Selleckchem | PH797804 | p38α inhibitor |
| BIRB796 | Selleckchem | S1574 | p38α inhibitor |
| SB203580 | Tocris | 1202 | p38α inhibitor |
| AMG 548 | Tocris | 3920 | p38α inhibitor |
| RWJ 67657 | Tocris | 2999 | p38α inhibitor |
| L-Skepinone | CBCS compound collection | p38α inhibitor | |
| Bovine serum albumin (BSA) | Sigma-Aldrich | A7030 | blocking agent |
| SDS (sodium dodecyl sulfate) | BDH | 44244 | used in antigen retrieval |
| Glycine | Sigma-Aldrich | G8898 | used in antigen retrieval |
| A-431 cells | ATCC | ATC-CRL-1555 | |
| Echo 550 | Labcyte | For preparation of compound plates | |
| Plate sealer | Agilent | PlateLoc | |
| Bulk reagent dispenser | Thermo Scientific | 5840300 | Multidrop Combi |
| Automated liquid handling | Agilent | Bravo liquid handling platform; used for compound plate preparation | |
| Plate washer | Tecan | Hydrospeed | |
| Water bath | Julabo | TW12 | |
| Thermocouple | VWR | Thermocouple traceable lab thermometer | |
| High content imager | Molecular Devices | ImageXpress Micro XLS Widefield High-Content Analysis System |
References
- Morgan, P., et al. Impact of a five-dimensional framework on R&D productivity at AstraZeneca. Nature Reviews Drug Discovery. 17 (3), 167-181 (2018).
- Freedman, L. P., Cockburn, I. M., Simcoe, T. S. The Economics of Reproducibility in Preclinical Research. PLOS Biology. 13 (6), e1002165 (2015).
- Waring, M. J., et al. An analysis of the attrition of drug candidates from four major pharmaceutical companies. Nature Reviews Drug Discovery. 14 (7), 475-486 (2015).
- Morgan, P., et al. Can the flow of medicines be improved? Fundamental pharmacokinetic and pharmacological principles toward improving Phase II survival. Drug Discovery Today. 17 (9), 419-424 (2012).
- Bunnage, M. E., Chekler, E. L. P., Jones, L. H. Target validation using chemical probes. Nature Chemical Biology. 9 (4), 195-199 (2013).
- Schürmann, M., Janning, P., Ziegler, S., Waldmann, H. Small-Molecule Target Engagement in Cells. Cell Chemical Biology. 23 (4), 435-441 (2016).
- Robers, M. B., et al. Target engagement and drug residence time can be observed in living cells with BRET. Nature Communications. 6, 10091 (2015).
- Martinez Molina, D., et al. Monitoring drug target engagement in cells and tissues using the cellular thermal shift assay. Science. 341 (6141), 84-87 (2013).
- Martinez Molina, D., Nordlund, P. The Cellular Thermal Shift Assay: A Novel Biophysical Assay for In situ Drug Target Engagement and Mechanistic Biomarker Studies. Annual Review of Pharmacology and Toxicology. 56, 141-161 (2016).
- Jafari, R., et al. The cellular thermal shift assay for evaluating drug target interactions in cells. Nature Protocols. 9 (9), 2100-2122 (2014).
- Almqvist, H., et al. CETSA screening identifies known and novel thymidylate synthase inhibitors and slow intracellular activation of 5-fluorouracil. Nature Communications. 7, 11040 (2016).
- Axelsson, H., et al. In situ Target Engagement Studies in Adherent Cells. ACS Chemical Biology. 13 (4), 942-950 (2018).
- Seashore-Ludlow, B., Perspective Lundbäck, T. E. a. r. l. y. Microplate Application of the Cellular Thermal Shift Assay (CETSA). Journal of Biomolecular Screening. 21 (10), 1019-1033 (2016).
- Axelsson, H., Almqvist, H., Seashore-Ludlow, B., Lundback, T., Sittampalam, G. S., et al. . Assay Guidance Manual [Internet]. , (2016).
- Mateus, A., et al. Prediction of intracellular exposure bridges the gap between target- and cell-based drug discovery. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 114 (30), E6231-E6239 (2017).
