Используя высокое содержание Imaging для количественного определения целевых участия в адэрентных клеток
Summary
Измерения поражения цели наркотиков являются центральным элементом разработки эффективных лекарств и химических зонд проверки. Здесь мы подробно протокол для измерения наркотиков целевых участия, используя высокое содержание изображений в Гонав совместимых адаптация сотовых тепловой сдвиг анализа (CETSA).
Abstract
Quantitating взаимодействие малых молекул с их предполагаемой белка цели имеет решающее значение для разработки лекарств, целевые проверки и проверки химических зонд. Методы, позволяющие оценить это явление без изменения целевого белка или малые молекулы особенно ценный, хотя технически сложным. Assay сотовой тепловой сдвига (CETSA) является одним из способов для отслеживания целевых участия в живых клетках. Здесь мы описываем адаптация оригинальной CETSA протокол, который позволяет для высокой пропускной способностью измерений при сохранении субцеллюлярные локализации на уровне отдельной ячейки. Мы считаем, что этот протокол предлагает важные успехи в приложение CETSA для углубленного характеристику соединения целевого взаимодействия, особенно в гетерогенной популяции клеток.
Introduction
При разработке новых лекарств или химические датчики, важно пару наблюдаемых Фармакологический эффект или функциональной индикации измерений целевой размещение или участия в живых клеток в1,2,3. Эти данные необходимы для обеспечения что малые молекулы фактически достигает желаемой цели и проверки биологических гипотеза позади белка целевого отбора4,5. Кроме того во время разработки лекарств, модель системы возрастающей сложности используются для выбора и подтвердить свинца соединения до клинических испытаний. Чтобы подтвердить перевод биологии через эти доклинические систем, методы для отслеживания наркотиков целевых участия и сопровождающие биологии на протяжении всего этого процесса развития являются критическими.
Наркотики целевых участия традиционно сложной для мониторинга в живых клеток с unfunctionalized малых молекул и белков, особенно на уровне одной ячейки с пространственным разрешением6,7. Один из последних методов наблюдать взаимодействие между неизмененной наркотиков и белков в живых клеток является пробирного сотовой тепловой сдвиг (CETSA), в котором лиганд индуцированной стабилизации родной белка в ответ на вызов тепла является количественных8, 9,10. Это достигается путем количественной оценки оставшихся растворимого белка после воздействия тепла вызов. В первоначальное раскрытие CETSA Западная помарка была использована для обнаружения. Чтобы включить скрининг кампаний и ударил сортировка больших составных коллекций, усилия увеличить пропускную способность CETSA экспериментов привели к разработке нескольких однородных, основанный на Гонав анализов10,11. Однако одно ограничение с помощью этих методов является, что они в настоящее время лучше всего подходят для соединения лечения в клеточных суспензий и обнаружения требует лизис клеток, приводя к потере пространственной информации. CETSA может быть применена экспериментально, либо как лиганд индуцированного сдвига в тепловой агрегат температуры (общT) на одну концентрацию малые молекулы или лигандом концентрации, необходимой для стабилизации белка в одной температуры. Последняя называется изотермический дозы ответ отпечатки пальцев (ITDRF) для обозначения зависимость этих измерений на конкретных экспериментальных условиях.
Цель настоящего Протокола заключается в измерения поражения цели с помощью CETSA в адэрентных клеток immunofluorescent обнаружения антител (если) с высоким содержанием микроскопии12. Эта процедура расширяет оригинальный CETSA платформа для одноклеточных количественного определения целевых участия с сохранением субцеллюлярные локализации. В частности в отличие от многих предыдущих докладах, в этой процедуре составные лечение проводится в живых адэрентных клеток без поверхности отряд или стирки перед проблемой тепла, таким образом, сохраняя равновесие созданной привязки, мы стремимся, чтобы измерить13. В настоящее время метод проверяется на один целевой белок p38α (MAPK14) в несколько ячеек, строк, и мы надеемся, что путем обмена этой процедуры метод может быть применен широко по всей плавильной протеома. Мы ожидаем, что этот протокол может быть адаптирована в конвейере развития наркотиков от скрининга, хит классифицирование посредством мониторинга целевых участия в естественных условиях.
Protocol
Representative Results
Discussion
Как обсуждалось в разделе результаты, существует несколько ключевых шагов к процедуре. Во-первых важно определить реагент сродство высокого качества. Мы рекомендуем, скрининг небольшую библиотеку антител для каждой требуемой цели. После того, как был выбран основное антитело, также ва…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Авторы признают, поддержку инфраструктуры от науки для жизни лабораторных и Каролинского института. Авторы также признают ввода и обсуждений с Michaela Vallin, Магдалена Otrocka и Томас Lundbäck.
Materials
| Phosphate-buffered saline (PBS) | Medicago | 09-9400-100 | |
| TrypLE Express | ThermoFisher Scientific | 12604013 | for detaching cells and subculturing |
| 16% paraformaldehyde (PFA) | ThermoFisher Scientific | 28908 | fixative |
| Goat anti-rabbit IgG (H+L), Alexa Fluor 488 conjugated antibody | ThermoFisher Scientific | A11008 | secondary antibody |
| HCS CellMask Red stain | ThermoFisher Scientific | H32712 | Cytoplasm stain |
| NP-40 | Sigma-Aldrich | 56741 | for permeabilization |
| Hoechst stain 33342 | Sigma-Aldrich | B2261 | nuclear stain |
| Dulbecco’s modified Eagle’s medium (DMEM) – high Glucose | Sigma-Aldrich | 6429 | cell culture media component |
| Heat-inactivated fetal bovine serum (FBS) | Sigma-Aldrich | F9665 | cell culture media component |
| Penicillin-Streptomycin | Sigma-Aldrich | P4333 | cell culture media component |
| Corning, breathable plate seal | Sigma-Aldrich | CLS3345 | for copound incubation step |
| Rabbit anti-p38 antibody [E229] | Abcam | ab170099 | primary antibody, LOT:GR305364-16 |
| Falcon, Black 384-well clear bottom imaging plates | VWR | 736-2044 | imaging plates |
| Greiner, 384-well low volume polypropylene plates | VWR | 784201 | |
| Adhesive aluminum foil | VWR | 30127790 | |
| Peelable aluminium seal | Agilent | 24210-001 | for PlateLoc |
| LY2228820 | Selleckchem | S1494 | p38α inhibitor |
| PH797804 | Selleckchem | PH797804 | p38α inhibitor |
| BIRB796 | Selleckchem | S1574 | p38α inhibitor |
| SB203580 | Tocris | 1202 | p38α inhibitor |
| AMG 548 | Tocris | 3920 | p38α inhibitor |
| RWJ 67657 | Tocris | 2999 | p38α inhibitor |
| L-Skepinone | CBCS compound collection | p38α inhibitor | |
| Bovine serum albumin (BSA) | Sigma-Aldrich | A7030 | blocking agent |
| SDS (sodium dodecyl sulfate) | BDH | 44244 | used in antigen retrieval |
| Glycine | Sigma-Aldrich | G8898 | used in antigen retrieval |
| A-431 cells | ATCC | ATC-CRL-1555 | |
| Echo 550 | Labcyte | For preparation of compound plates | |
| Plate sealer | Agilent | PlateLoc | |
| Bulk reagent dispenser | Thermo Scientific | 5840300 | Multidrop Combi |
| Automated liquid handling | Agilent | Bravo liquid handling platform; used for compound plate preparation | |
| Plate washer | Tecan | Hydrospeed | |
| Water bath | Julabo | TW12 | |
| Thermocouple | VWR | Thermocouple traceable lab thermometer | |
| High content imager | Molecular Devices | ImageXpress Micro XLS Widefield High-Content Analysis System |
References
- Morgan, P., et al. Impact of a five-dimensional framework on R&D productivity at AstraZeneca. Nature Reviews Drug Discovery. 17 (3), 167-181 (2018).
- Freedman, L. P., Cockburn, I. M., Simcoe, T. S. The Economics of Reproducibility in Preclinical Research. PLOS Biology. 13 (6), e1002165 (2015).
- Waring, M. J., et al. An analysis of the attrition of drug candidates from four major pharmaceutical companies. Nature Reviews Drug Discovery. 14 (7), 475-486 (2015).
- Morgan, P., et al. Can the flow of medicines be improved? Fundamental pharmacokinetic and pharmacological principles toward improving Phase II survival. Drug Discovery Today. 17 (9), 419-424 (2012).
- Bunnage, M. E., Chekler, E. L. P., Jones, L. H. Target validation using chemical probes. Nature Chemical Biology. 9 (4), 195-199 (2013).
- Schürmann, M., Janning, P., Ziegler, S., Waldmann, H. Small-Molecule Target Engagement in Cells. Cell Chemical Biology. 23 (4), 435-441 (2016).
- Robers, M. B., et al. Target engagement and drug residence time can be observed in living cells with BRET. Nature Communications. 6, 10091 (2015).
- Martinez Molina, D., et al. Monitoring drug target engagement in cells and tissues using the cellular thermal shift assay. Science. 341 (6141), 84-87 (2013).
- Martinez Molina, D., Nordlund, P. The Cellular Thermal Shift Assay: A Novel Biophysical Assay for In situ Drug Target Engagement and Mechanistic Biomarker Studies. Annual Review of Pharmacology and Toxicology. 56, 141-161 (2016).
- Jafari, R., et al. The cellular thermal shift assay for evaluating drug target interactions in cells. Nature Protocols. 9 (9), 2100-2122 (2014).
- Almqvist, H., et al. CETSA screening identifies known and novel thymidylate synthase inhibitors and slow intracellular activation of 5-fluorouracil. Nature Communications. 7, 11040 (2016).
- Axelsson, H., et al. In situ Target Engagement Studies in Adherent Cells. ACS Chemical Biology. 13 (4), 942-950 (2018).
- Seashore-Ludlow, B., Perspective Lundbäck, T. E. a. r. l. y. Microplate Application of the Cellular Thermal Shift Assay (CETSA). Journal of Biomolecular Screening. 21 (10), 1019-1033 (2016).
- Axelsson, H., Almqvist, H., Seashore-Ludlow, B., Lundback, T., Sittampalam, G. S., et al. . Assay Guidance Manual [Internet]. , (2016).
- Mateus, A., et al. Prediction of intracellular exposure bridges the gap between target- and cell-based drug discovery. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 114 (30), E6231-E6239 (2017).
