Met behulp van hoog gehalte Imaging om te kwantificeren Target Engagement in Adherente cellen

Bij het ontwikkelen van nieuwe geneesmiddelen of chemische sondes er absoluut voor het koppelen van de waargenomen farmacologisch effect of functionele uitlezing aan metingen van doel bezetting of engagement in levende cellen^1,2,3. Deze gegevens zijn nodig om ervoor te zorgen dat de kleine molecule in feite haar gewenste doel bereikt, zowel voor het valideren van de biologische hypothese achter eiwit target selectie^4,5. Bovendien, tijdens Geneesmiddelenontwikkeling, modelsystemen van toenemende complexiteit worden gebruikt om te selecteren en bevestigen van een voorsprong samengestelde voorafgaand aan klinische proeven. Om te bevestigen vertaling van biologie over deze preklinische systemen, zijn methoden voor het traceren van drug-target engagement en bijbehorende biologie in dit ontwikkelingsproces kritisch.

Drug-target engagement is van oudsher uitdagend om te controleren in levende cellen met unfunctionalized kleine moleculen en proteïnen, vooral op het niveau van de eencellige met ruimtelijke resolutie^6,7. Een recente methode voor het waarnemen van de interactie tussen ongewijzigd drugs en eiwitten in levende cellen is de cellulaire thermische shift test (CETSA) waarin ligand-geïnduceerde stabilisatie van een natuurlijk eiwit in antwoord op de uitdaging van een warmte is gekwantificeerde^{8, 9,10}. Dit wordt bereikt door het kwantificeren van de resterende oplosbaar eiwit na blootstelling aan een uitdaging van de warmte. In de eerste vermelding van CETSA, werd westelijke vlek gebruikt voor de detectie. Om te schakelen van screening campagnes en sloeg triaging van grotere samengestelde collecties, hebben inspanningen om de doorvoer van CETSA experimenten geleid tot de ontwikkeling van verschillende homogene, microplaat assays^10,11. Echter, een beperking met deze methoden is dat zij momenteel het best voor samengestelde behandeling in cel suspensies geschikt zijn en de detectie lysis van de cel vereist, wat leidt tot verlies van ruimtelijke informatie. CETSA kan worden toegepast in experimenteel als een ligand-geïnduceerde verschuiving in thermische aggregatie temperatuur (T_agg) op een enkele concentratie van het kleine molecuul of het ligand nodig om te stabiliseren van het eiwit bij een interne temperatuur. De laatste heet isothermische dosis reactie vingerafdrukken (ITDRF) om aan te duiden van de afhankelijkheid van deze metingen op de specifieke experimentele omstandigheden.

Het doel van dit protocol is voor het meten van betrokkenheid van de doelgroep met behulp van CETSA in Adherente cellen door immunefluorescentie (IF) antistofdetectie met hoge-inhoud microscopie¹². Deze procedure strekt zich uit van de oorspronkelijke CETSA platform te maken voor eencellige kwantificering van target engagement met behoud van subcellular localisatie. Met name, in tegenstelling tot vele eerdere verslagen in deze procedure samengestelde behandeling wordt uitgevoerd in levende Adherente cellen zonder oppervlakte detachement of wassen vóór de uitdaging van de warmte, dus het behoud van het evenwicht van de vastgestelde bindende willen we meten van¹³. Op dit moment de methode is gevalideerd voor één doel eiwit p38α (MAPK14) in verschillende cellijnen, en we hopen dat door het delen van deze procedure de techniek kan worden toegepast in grote lijnen op de smeltende Proteoom. Wij verwachten dat dit protocol kan worden aangepast in de drug ontwikkeling pijpleiding van screening, hit triaging via toezicht op target engagement in vivo.