À l’aide de contenu élevé d’imagerie afin de quantifier l’Engagement de cibles en cellules adhérentes

Lors de l’élaboration de nouveaux médicaments ou sondes chimiques, il est indispensable de coupler l’effet pharmacologique observé ou lecture fonctionnelle aux mesures de l’occupation de la cible ou l’engagement dans des cellules vivantes^1,2,3. Ces données sont nécessaires pour s’assurer que la petite molécule a en effet atteint sa cible recherchée tant pour valider l’hypothèse biologique derrière la protéine cible sélection^4,5. En outre, au cours du développement de médicaments, systèmes de modèles de complexité croissante servent à sélectionner et à corroborer un chef de file avant les essais cliniques. Pour confirmer la traduction de biologie dans l’ensemble de ces systèmes précliniques, les méthodes pour tracer les fiançailles de drogue-cible et accompagnant la biologie tout au long de ce processus de développement sont essentiels.

Engagement de drogue-cible est traditionnellement difficile à surveiller dans des cellules vivantes avec tétrahydrofuraniques de petites molécules et des protéines, notamment au niveau unicellulaire avec une résolution spatiale de^6,7. Une méthode récente pour observer l’interaction entre tels quels médicaments et protéines dans des cellules vivantes est l’analyse de cellulaire décalage thermique (CETSA) dans lequel stabilisation induite par le ligand d’une protéine native en réponse à un défi de chaleur est quantifiée^{8, 9,10}. Ceci est accompli en quantifiant les protéines solubles restantes après exposition à une épreuve de la chaleur. Dans la notification initiale de CETSA, tache occidentale a été utilisée pour la détection. Pour activer les campagnes de dépistage et a frappé le triage des plus grandes collections de composés, efforts pour augmenter le débit de CETSA expériences ont conduit à l’élaboration de plusieurs essais homogènes, axée sur la microplaque^10,11. Toutefois, une limitation avec ces méthodes est qu’elles sont actuellement mieux adaptées à un traitement composé des suspensions cellulaires et la détection exige la lyse cellulaire, conduisant à la perte de l’information spatiale. CETSA peut être appliqué expérimentalement soit comme un changement induite par le ligand température agrégation thermique (T_tot.) à une concentration unique de la petite molécule ou la concentration de ligand nécessaire pour stabiliser la protéine à une seule température. Ce dernier est appelé empreintes de réponse dose isotherme (ITDRF) pour signifier la dépendance à l’égard de ces mesures sur les conditions expérimentales spécifiques.

Le but du présent protocole est de mesurer l’engagement de cibles à l’aide de CETSA dans les cellules adhérentes de détection des anticorps par immunofluorescence (IF) avec la microscopie haute teneur¹². Cette procédure s’étend la plate-forme CETSA originale permettant la quantification unicellulaire de l’engagement de cibles avec conservation de la localisation subcellulaire. En particulier, contrairement à nombreux rapports précédents, dans cette procédure composé traitement est effectué dans des cellules vivantes adhérentes sans détachement de surface ou de lavage avant le défi de la chaleur, afin de préserver l’équilibre de liaison établis que nous voulons mesurer¹³. Actuellement, la méthode est validée pour une cible protéine p38α (MAPK14) en plusieurs lignées de cellules, et nous espérons qu’en partageant cette procédure la technique peut être appliquée largement à travers la fusion proteome. Nous prévoyons que ce protocole peut être adaptée dans l’ensemble du pipeline de développement de drogue de dépistage, hit triage grâce au suivi de cible engagement in vivo.