Planta de crecimiento y transformación mediada por Agrobacterium de baño Floral de la Extremophyte Schrenkiella parvula
Summary
Transformación mediada por Agrobacterium utilizando un método de inmersión floral puede ser empleado con éxito para crear líneas transgénicas estables del modelo extremophyte Schrenkiella parvula. Presentamos un protocolo modificado de eso para Arabidopsis thaliana, teniendo en cuenta los hábitos de crecimiento diferentes y características fisiológicas de la extremophyte.
Abstract
Schrenkiella parvula es un extremophyte adaptado a varios abiótico, incluyendo múltiples tensiones de la toxicidad de iones. A pesar de recursos genómicos de alta calidad disponibles para el estudio de cómo las plantas se adaptan a ambiente destaca, su valor como un modelo de genómica funcional y la herramienta ha sido limitada por la falta de un sistema de transformación posible. En este protocolo, informe cómo generar transgénicos estable S. parvula líneas utilizando un método de inmersión floral mediada por Agrobacterium. Modificamos el protocolo de transformación utilizado para a. thaliana para tener en cuenta las características únicas de S. parvula, como un hábito de floración indeterminada y un contenido alto de cera epicuticular en las hojas. Brevemente, las semillas de S. parvula se estratificaron a 4 ° C durante cinco días antes de la siembra. Las plantas fueron cultivadas en un fotoperiodo de luz 14 h y 10 h oscuro y una 130 μmol m-2s-1 intensidad de la luz, a 22 ° C a 24 ° C. Ocho a nueve semanas de edad las plantas con inflorescencias múltiples fueron seleccionado para la transformación. Estas inflorescencias se sumergieron en una solución de infiltración de Agrobacterium tumefaciens GV3101 llevan el plásmido pMP90RK . Se realizaron dos rondas de flor de inmersión con un intervalo de tres a cuatro semanas para aumentar la eficiencia de transformación. Las semillas de T1 fueron recogidas y secadas durante cuatro semanas en un recipiente con desecante antes de germinación a pantalla para candidato transforma líneas. Resistencia a la BASTA fue utilizada para plantas de T1. Pulveriza la solución BASTA tres veces con un intervalo de tres días a partir de dos semanas de edad las plantas reducir falsos positivos. Se realizó una prueba de gota BASTA de sobrevivir las plantas individuales para identificar transformantes positivo verdadero. La eficiencia de transformación fue 0,033%, obtención de plantas transgénicas de 3 a 4 por 10.000 semillas T1 propagadas.
Introduction
En este protocolo, se describen el crecimiento y establecimiento de líneas transgénicas estables para el modelo extremophyte Schrenkiella parvula. La disponibilidad de un sistema eficiente de transformación es una característica distintiva de cualquier modelo genético. Plantas que prosperan en ambientes extremos, que se refiere como extremophytes, proporcionan un recurso crítico para la comprensión de adaptaciones de la planta al estrés ambiental. Schrenkiella parvula (anteriormente Thellungiella parvula y Eutrema parvulum) es una modelo extremophyte, con la expansión de recursos genómicos1,2,3,4,5. Sin embargo, protocolos de transformación aún no han sido denunciados por S. parvula en estudios publicados.
El genoma de S. parvula es el primer genoma de extremophyte publicado en Brassicaceae (familia de mostaza-col) y muestra un extenso synteny genoma total con el modelo no-extremophyte,1de Arabidopsis thaliana. Por lo tanto, estudios comparativos entre la a. thaliana y S. parvula podrían beneficiarse de la riqueza de los estudios genéticos realizados en a. thaliana para hacer hipótesis informativas sobre cómo ha evolucionado y regulado el genoma de S. parvula diferente para hacer frente a extremos ambientales destaca5,6,7. Parvula de S. es una de las especies más tolerantes a la sal (basadas en suelo NaCl LD50) entre conocidos parientes silvestres de a. thaliana8. Además de la tolerancia de NaCl, S. parvula sobrevive y completa su ciclo de vida en presencia de varios iones sal a altas concentraciones de tóxicos para la mayoría de las plantas7. En respuesta al estrés abiótico en su hábitat natural, ha evolucionado varios rasgos, entre los cuales varios han sido estudiados en la bioquímica o fisiológica nivel 8,9,10, 11.
Desde 2010, ha habido más de 400 publicaciones peer-reveiwed que utilizan S. parvula como una especie de objetivo o utilizan en comparación con otros genomas de plantas. Sin embargo, un evidente cuello de botella se podía identificar con un vistazo de qué tipo de estudios se han realizado. La mayoría de estos informes discutir el potencial uso de parvula S. en futuros estudios o usos en genómica comparativa y estudios de phylogenomic. Debido a la falta de un protocolo de prueba de concepto de transformación establecido por S. parvula, no se ha utilizado en estudios de genómica funcional, a pesar de tener uno de los genomas de plantas de calidad más alta disponibles hasta la fecha (> 5 Mb contig N50) montado y anotado en pseudomolecules nivel del cromosoma1.
El método de transformación mediada por Agrobacterium de inmersión floral se ha convertido en el método más ampliamente usado para crear líneas trasngenic en a. thaliana, y el desarrollo de un sistema reproducible de transformación fue un factor decisivo en su éxito como una modelo genético12,13. Sin embargo, no todas las especies de Brassicaceae se han demostrado para ser transformado con éxito usando el método de inmersión floral desarrollado de a. thaliana. Especialmente, las especies de Brassicaceae Lineage II que incluyen S. parvula ha sido recalcitrante a los métodos de transformación base floral dip14,15.
El hábito de crecimiento indeterminado de la floración de S. parvula, combinado con su morfología de hoja estrecha, ha hecho difícil adoptar el método de transformación de floral dip estándar mediada por Agrobacterium. En este estudio, Divulgamos el protocolo modificado que hemos desarrollado para la transformación reproducible de S. parvula.
Protocol
Representative Results
Discussion
El estado fisiológico de la planta influye significativamente en la eficiencia de transformación25. El uso de plantas sanas y vigorosas para la transformación es un requisito clave para la exitosa transformación en S. parvula. Agua o luz plantas tendrán menos flores en comparación con las plantas saludables ideales para la transformación (figura 1, panel central). Parvula de S. puede crecer en una intensidad de luz inferior a 130 μmol m-…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabajo fue apoyado por un premio de la Fundación Nacional de Ciencias 1616827 de MCB.
Materials
| Agar | VWR International, Radnor, PA | 90000-762 | Bacto Agar Soldifying Agent, BD Diagnostics |
| B5 vitamins | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO | G1019 | Gamborg’s Vitamin Solution |
| Desiccant | W A Hammond Drierite, Xenia, OH | 22005 | Indicating DRIERITE 6 mesh |
| Destination vector for plant transformation | TAIR | Vector:6531113857 | pKGWFS7 |
| Electroporation cuvette | USA Scientific | 9104-5050 | Electroporation cuvette, round cap, 0.2 cm gap |
| Electroporator | BIO-RAD Laboratories, Hercules, CA | 1652100 | MicroPulser Electroporator |
| Fertilizer beads | Osmocote Garden, Marysville, OH | N/A | Osmocote Smart-Release Plant Food Flower & Vegetable |
| Gel extraction kit | iNtRON Biotechnology, Boston, MA | 17289 | MEGAquick-spin Total fragment DNA purification kit |
| Gentamicin | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO | G1914-5G | Gentamicin sulfate |
| Glufosinate-ammonium (11.3%) herbicide (BASTA) | Bayer environmental science, Montvale, NJ | N/A | FINALE herbicide |
| Kanamycin | VWR International, Radnor, PA | 200004-444 | Kanamycin monosulfate |
| MES | Bioworld, Dublin, OH | 41320024-2 | MES, Free Acid |
| MS salt | MP Biomedicals, Santa Anna, CA | 092621822 | Hoagland's modified basal salt mixture |
| N6-benzylaminopurine (BA) | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO | B3274 | 6-Benzylaminopurine solution |
| NaCl | Sigma-Alrich | S7653 | Sodium chloride |
| Non-ionic detergent | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO | 9005-64-5 | TWEEN 20 |
| Plasmid isolation kit | Zymo Research, Irvine, CA | D4036 | Zyppy Plasmid Kits |
| Recombinase enzyme mix kit | Life Technology | 11791-020 | Gateway LR Clonase II Enzyme mix |
| Rifampicin | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO | R3501-1G | Rifampicin, powder, >= 97% (HPLC) |
| Shaking incubator | ThermoFisher Scientific, Waltham, MA | SHKE4450 | MaxQ 4450 Benchtop Orbital Shakers |
| Soil mix | Sun Gro | SUN239223328CFLP | Sun Gro Metro-Mix 360 Grower Mix |
| Spectinomycin | VWR International, Radnor, PA | IC15206705 | |
| Sterile 50ml conical tubes | USA Scientific, Ocala, FL | 1500-1811 | 50 ml conical screw cap tubes, copolymer, racks, sterile |
| Sucrose | VWR International, Radnor, PA | 57-50-1 | Sucrose, ACS |
| Surfactant solution | Lehle seeds, Round Rock, TX | VIS-02 | Silwet L-77 |
| Topoisomerase-based cloning kit | Life Technologies, Carlsbad, CA | K240020 | pENTR/D-TOPO Cloning Kit, with One Shot TOP10 Chemically Competent E. coli |
| Tryptone | VWR International, Radnor, PA | 90000-282 | BD Bacto Tryptone, BD Biosciences |
| Yeast Extract | VWR International, Radnor, PA | 90000-722 | BD Bacto Yeast Extract, BD Biosciences |
References
- Dassanayake, M., et al. The genome of the extremophile crucifer Thellungiella parvula. Nature Genetics. 43 (9), 913-918 (2011).
- Oh, D. -. H., Dassanayake, M., Bohnert, H. J., Cheeseman, J. M. Life at the extreme: lessons from the genome. Genome Biology. 13 (3), 241 (2012).
- Whited, J. The Next Top Models. Cell. 163 (1), 18-20 (2015).
- Dassanayake, M., Yun, D. O. D., Bressan, R. A., Cheeseman, J. M., Bohnert, J. H. The scope of things to come: New paradigms in biotechnology. Plant Biotechnology and Agriculture: Prospects for the 21st Century. , 19-34 (2009).
- Dittami, S. M., Tonon, T. Genomes of extremophile crucifers: New platforms for comparative genomics and beyond. Genome Biology. 13 (8), 166 (2012).
- Amtmann, A. Learning from evolution: Thellungiella generates new knowledge on essential and critical components of abiotic stress tolerance in plants. Molecular Plant. 2 (1), 3-12 (2009).
- Oh, D. -. H., Hong, H., Lee, S. Y., Yun, D. -. J., Bohnert, H. J., Dassanayake, M. Genome structures and transcriptomes signify niche adaptation for the multiple-ion-tolerant extremophyte Schrenkiella parvula. Plant Physiology. 164 (4), 2123-2138 (2014).
- Orsini, F., et al. A comparative study of salt tolerance parameters in 11 wild relatives of Arabidopsis thaliana. Journal of Experimental Botany. 61 (13), 3787-3798 (2010).
- Uzilday, B., Ozgur, R., Sekmen, A. H., Yildiztugay, E., Turkan, I. Changes in the alternative electron sinks and antioxidant defence in chloroplasts of the extreme halophyte Eutrema parvulum (Thellungiella parvula) under salinity. Annals of Botany. 115 (3), 449-463 (2015).
- Teusink, R. S., Rahman, M., Bressan, R. A., Jenks, M. A. Cuticular waxes on Arabidopsis thaliana close relatives Thellungiella halophila and Thellungiella parvula. International Journal of Plant Sciences. 163 (2), 309-315 (2002).
- Jarvis, D. E., Ryu, C. H., Beilstein, M. A., Schumaker, K. S. Distinct roles for SOS1 in the convergent evolution of salt tolerance in Eutrema salsugineum and Schrenkiella parvula. Molecular Biology and Evolution. 31 (8), 2094-2107 (2014).
- Clough, S. J., Bent, A. F. Floral dip: A simplified method for Agrobacterium-mediated transformation of Arabidopsis thaliana. Plant Journal. 16 (6), 735-743 (1998).
- Koornneef, M., Meinke, D. The development of Arabidopsis as a model plant. Plant Journal. 61 (6), 909-921 (2010).
- Bai, J., Wu, F., Mao, Y., He, Y. In planta transformation of Brassica rapa and B. napus via vernalization-infiltration methods. Protocol Exchange. 10, 1028 (2013).
- Sparrow, P. A. C., Goldsack, C. M. P., Østergaard, L. Transformation technology in the Brassicaceae. Genetics and Genomics of the Brassicaceae. , 505-525 (2011).
- Hoagland, D. R., Arnon, D. I. The water-culture method for growing plants without soil. California Agricultural Experiment Station Circular. 347 (347), 1-32 (1950).
- Saiki, R., et al. Primer-directed enzymatic amplification of DNA with a thermostable DNA polymerase. Science. 239 (4839), 487-491 (1988).
- Sun, Y., Sriramajayam, K., Luo, D., Liao, D. J. A Quick, cost-free method of purification of dna fragments from agarose gel. Journal of Cancer. 3, 93-95 (2012).
- Sanger, F., Nicklen, S., Coulson, A. R. DNA sequencing with chain-terminating inhibitors. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 74 (12), 5463-5467 (1977).
- Bertani, G. Studies on Lysogenesis I. The mode of phage liberation by lysogenic Eschericia coli. Journal of Bacteriolgy. 62 (3), 293-300 (1951).
- Koncz, C., Martini, N., Szabados, L., Hrouda, M., Bachmair, A., Schell, J. Specialized vectors for gene tagging and expression studies. Plant Molecular Biology Manual. , 53-74 (1994).
- Weigel, D., Glazebrook, J. Transformation of Agrobacterium using electroporation. Cold Spring Harbor Protocols. 2006 (30), (2006).
- Murray, M. G., Thompson, W. F. Rapid isolation of high molecular weight plant DNA. Nucleic Acids Research. 8 (19), 4321-4326 (1980).
- Inan, G. Salt cress. a halophyte and cryophyte Arabidopsis relative model system and its applicability to molecular genetic analyses of growth and development of extremophiles. Plant Physiol. 135 (3), 1718-1737 (2004).
- Ghedira, R., De Buck, S., Nolf, J., Depicker, A. The efficiency of Arabidopsis thaliana floral dip transformation is determined not only by the Agrobacterium strain used but also by the physiology and the ecotype of the dipped plant. Molecular Plant-Microbe Interactions. 26 (7), 823-832 (2013).
- Shaohong, F. U., Xianya, W. E. I., Yingze, N. I. U., Shixing, G. U. O. Transformation of Brassica napus with the method of floral-dip. Biotechnology: Genomics and Its Applications. , 45-49 (2005).
- Li, J., Tan, X., Zhu, F., Guo, J. A rapid and simple method for Brassica napus floral-dip transformation and selection of transgenic plantlets. International Journal of Biology. 2 (1), 127 (2010).
- Li, H. Q., Xu, J., Chen, L., Li, M. R. Establishment of an efficient Agrobacterium tumefaciens-mediated leaf disc transformation of Thellungiella halophila. Plant Cell Reports. 26 (10), 1785-1789 (2007).
- Wu, G., Rossidivito, G., Hu, T., Berlyand, Y., Poethig, R. S. Traffic lines: New tools for genetic analysis in Arabidopsis thaliana. Genetics. 200 (1), 35-45 (2015).
