النباتات النمو والتحول فلورال-تراجع المتبعة بوساطة من اكستريموفيتي بارفولا شرينكيلا
Summary
التحول المتبعة بوساطة استخدام أسلوب الأزهار تراجع يمكن أن تستخدم بنجاح لإنشاء خطوط المعدلة وراثيا مستقرة من طراز اكستريموفيتي بارفولا شرينكيلا. نحن نقدم على بروتوكول تعديل من أن نبات التمويل، النظر في عادات مختلفة للنمو والخصائص الفسيولوجية اكستريموفيتي.
Abstract
بارفولا شرينكيلا اكستريموفيتي تكييف الإجهادات اللاأحيائية المختلفة، بما في ذلك عدة تؤكد سمية أيون. على الرغم من الموارد المجينية عالية الجودة المتاحة لدراسة كيفية تكييف النباتات للبيئة تؤكد، قيمته كنموذج الجينوم وظيفي وأداة كان محدودا بسبب الافتقار إلى نظام التحول ممكناً. في هذا البروتوكول، ونحن تقرير كيفية توليد المعدلة وراثيا مستقرة س. بارفولا خطوط باستخدام أسلوب الأزهار تراجع المتبعة بوساطة. قمنا بتعديل البروتوكول التحويل المستخدمة التمويل (أ) لحساب الصفات الفريدة من س. بارفولا، مثل عادة مزهرة غير محددة ومحتوى شمع ابيكوتيكولار عالية على أوراق. باختصار، كانت طبقات البذور بارفولا س. عند 4 درجة مئوية لمدة خمسة أيام قبل الغرس. كانت تزرع النباتات في كبيرة ضوء ح 14 و 10 ح الظلام و 130 µmol م-2s-1 كثافة ضوء، عند 22 درجة مئوية إلى 24 درجة مئوية. تم اختيار ثمانية إلى تسعة مصانع منذ أسابيع مع إينفلوريسسينسيس متعددة للتحول. كانت انخفضت هذه إينفلوريسسينسيس في حل تسلل من GV3101 tumefaciens المتبعة يحمل بلازميد pMP90RK . ونحن إجراء جولتين من غمس الزهور مع الفاصل زمني من ثلاثة إلى أربعة أسابيع لزيادة كفاءة التحويل. تم جمع بذور T1 وتجفف لمدة أربعة أسابيع في حاوية مع ﻣﺟﻓﻓﺍﺗ قبل الإنبات على الشاشة لمرشح تحويل خطوط. واستخدمت المقاومة إلى باستا للشاشة النباتات T1. نحن رش الحل باستا ثلاث مرات بفاصل زمني لمدة ثلاثة أيام بدءاً من المحطتين أسبوع الحد من إيجابيات كاذبة. وأجرى اختبار إسقاط باستا على الباقين على قيد الحياة محطات فردية لتحديد ترانسفورمانتس إيجابية حقيقية. وكان كفاءة التحويل 0.033%، مما أسفر عن 3 – 4 النباتات المعدلة وراثيا كل بذور T1 10,000 روج.
Introduction
في هذا البروتوكول، يصف لنا النمو وإنشاء خطوط المعدلة وراثيا مستقرة لنموذج اكستريموفيتي بارفولا شرينكيلا. توافر نظام التحويل الفعال السمة مميزة لأي نموذج الوراثية تنوعاً. النباتات التي تزدهر في البيئات المتطرفة، المشار إليها اكستريموفيتيس، توفر موردا بالغ الأهمية لفهم التعديلات النبات للضغوط البيئية. بارفولا شرينكيلا (سابقا بارفولا ثيلونجيلا وبارفولوم يوتريما) نموذج اكستريموفيتي واحد مثل هذا، مع توسيع نطاق الموارد المجينية1،2،3،،من45. ومع ذلك، بروتوكولات التحول لم بعد تم تبلغ عن س. بارفولا في الدراسات المنشورة.
جينوم بارفولا س. الجينوم اكستريموفيتي المنشورة الأولى في الفصيلة الكرنبيه (الخردل-الملفوف الأسرة) ويظهر سينتيني جينوم شاملة واسعة النطاق مع النموذج غير اكستريموفيتي، أعطيت التمويل1. وهكذا، دراسات مقارنة بين التمويل أ وس. بارفولا يمكن أن تستفيد من ثروة الدراسات الجينية التي أجريت على التمويل (أ) جعل الفرضيات الزاخر بالمعلومات عن كيفية تطور الجينوم س. بارفولا وينظم بطريقة مختلفة للتعامل مع تشدد المتطرفة البيئية5،،من67. س. بارفولا واحد من الملوحة أكثر الأنواع (استناداً إلى التربة كلوريد الصوديوم LD50) بين الأقارب البرية المعروفة التمويل (أ)8. وبالإضافة إلى التسامح كلوريد الصوديوم، بارفولا س. على قيد الحياة، ويكمل دورة حياته حضور عدة أيونات الملح في تركيزات عالية السمية لمعظم النباتات7. استجابة للضغوط اللاأحيائية السائدة في بيئتها الطبيعية، قد تطورت سمات مختلفة، ومنها عدة وقد درست في الكيمياء الحيوية أو الفسيولوجية المستوى 8،9،10، 11.
منذ عام 2010، هناك ما يزيد على 400 الأقران-اطلعت المنشورات التي تستخدم بارفولا س. كأنواع مستهدفة أو استخدامه في مقارنة مع جينومات النباتات الأخرى. ومع ذلك، يمكن تحديد اختناق واضح مع إلقاء نظرة فاحصة لنوع ما من دراسات قد أجريت. غالبية هذه التقارير مناقشة إمكانية استخدام س. بارفولا في الدراسات المستقبلية أو استخدامه في مقارنة الجينوم أو الدراسات فيلوجينوميك. نظراً لعدم وجود بروتوكول التحول من مفهوم الإثبات المحددة س. بارفولا، فإنه لم يتم استخدامه في الدراسات الجينومية الوظيفية، على الرغم من وجود واحدة من أعلى نوعية النبات الجينوم المتاحة حتى الآن (> 5 ميغابايت contig N50) تجميع و المشروح في مستوى الكروموسوم بسيودوموليكوليس1.
وأصبحت الطريقة المتبعة بوساطة تحويل الأزهار تراجع الأسلوب الأكثر على نطاق واسع المستخدمة لإنشاء خطوط تراسنجينيك في التمويل (أ)، وتطوير نظام استنساخه من التحول كان عاملاً حاسما في نجاحها نموذج الوراثية12،13. ومع ذلك، تبين أن تتحول بنجاح باستخدام الأسلوب الأزهار تراجع المتقدمة التمويل (أ)ليست كل الفصيلة الكرنبيه الأنواع. خصيصا، والأنواع الثانية النسب الفصيلة الكرنبيه التي تتضمن بارفولا س. قد المعاندة للإزهار تراجع التحول يستند إلى أساليب14،15.
عادة النمو المزهرة غير محدد س. بارفولا، جنبا إلى جنب مع مورفولوجيا أوراق ضيقة، جعلت تحديا اعتماد الطريقة القياسية المتبعة بوساطة الأزهار تراجع التحول. في هذه الدراسة، ونحن تقرير البروتوكول المعدل وضعنا للتحول استنساخه من س. بارفولا.
Protocol
Representative Results
Discussion
الدولة الفسيولوجية للنبات يؤثر إلى حد كبير كفاءة التحويل25. استخدام النباتات صحية ونشطة للتحول شرط رئيسي لنجاح عملية التحول في بارفولا س. وسيكون الماء أو النباتات وأكد الخفيفة الزهور أقل مقارنة بالنباتات صحية مثالية للتحول (الشكل 1، مركز لوحة). س. بارفول…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
وأيد هذا العمل على جائزة مؤسسة العلوم الوطنية 1616827 المجلس.
Materials
| Agar | VWR International, Radnor, PA | 90000-762 | Bacto Agar Soldifying Agent, BD Diagnostics |
| B5 vitamins | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO | G1019 | Gamborg’s Vitamin Solution |
| Desiccant | W A Hammond Drierite, Xenia, OH | 22005 | Indicating DRIERITE 6 mesh |
| Destination vector for plant transformation | TAIR | Vector:6531113857 | pKGWFS7 |
| Electroporation cuvette | USA Scientific | 9104-5050 | Electroporation cuvette, round cap, 0.2 cm gap |
| Electroporator | BIO-RAD Laboratories, Hercules, CA | 1652100 | MicroPulser Electroporator |
| Fertilizer beads | Osmocote Garden, Marysville, OH | N/A | Osmocote Smart-Release Plant Food Flower & Vegetable |
| Gel extraction kit | iNtRON Biotechnology, Boston, MA | 17289 | MEGAquick-spin Total fragment DNA purification kit |
| Gentamicin | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO | G1914-5G | Gentamicin sulfate |
| Glufosinate-ammonium (11.3%) herbicide (BASTA) | Bayer environmental science, Montvale, NJ | N/A | FINALE herbicide |
| Kanamycin | VWR International, Radnor, PA | 200004-444 | Kanamycin monosulfate |
| MES | Bioworld, Dublin, OH | 41320024-2 | MES, Free Acid |
| MS salt | MP Biomedicals, Santa Anna, CA | 092621822 | Hoagland's modified basal salt mixture |
| N6-benzylaminopurine (BA) | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO | B3274 | 6-Benzylaminopurine solution |
| NaCl | Sigma-Alrich | S7653 | Sodium chloride |
| Non-ionic detergent | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO | 9005-64-5 | TWEEN 20 |
| Plasmid isolation kit | Zymo Research, Irvine, CA | D4036 | Zyppy Plasmid Kits |
| Recombinase enzyme mix kit | Life Technology | 11791-020 | Gateway LR Clonase II Enzyme mix |
| Rifampicin | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO | R3501-1G | Rifampicin, powder, >= 97% (HPLC) |
| Shaking incubator | ThermoFisher Scientific, Waltham, MA | SHKE4450 | MaxQ 4450 Benchtop Orbital Shakers |
| Soil mix | Sun Gro | SUN239223328CFLP | Sun Gro Metro-Mix 360 Grower Mix |
| Spectinomycin | VWR International, Radnor, PA | IC15206705 | |
| Sterile 50ml conical tubes | USA Scientific, Ocala, FL | 1500-1811 | 50 ml conical screw cap tubes, copolymer, racks, sterile |
| Sucrose | VWR International, Radnor, PA | 57-50-1 | Sucrose, ACS |
| Surfactant solution | Lehle seeds, Round Rock, TX | VIS-02 | Silwet L-77 |
| Topoisomerase-based cloning kit | Life Technologies, Carlsbad, CA | K240020 | pENTR/D-TOPO Cloning Kit, with One Shot TOP10 Chemically Competent E. coli |
| Tryptone | VWR International, Radnor, PA | 90000-282 | BD Bacto Tryptone, BD Biosciences |
| Yeast Extract | VWR International, Radnor, PA | 90000-722 | BD Bacto Yeast Extract, BD Biosciences |
References
- Dassanayake, M., et al. The genome of the extremophile crucifer Thellungiella parvula. Nature Genetics. 43 (9), 913-918 (2011).
- Oh, D. -. H., Dassanayake, M., Bohnert, H. J., Cheeseman, J. M. Life at the extreme: lessons from the genome. Genome Biology. 13 (3), 241 (2012).
- Whited, J. The Next Top Models. Cell. 163 (1), 18-20 (2015).
- Dassanayake, M., Yun, D. O. D., Bressan, R. A., Cheeseman, J. M., Bohnert, J. H. The scope of things to come: New paradigms in biotechnology. Plant Biotechnology and Agriculture: Prospects for the 21st Century. , 19-34 (2009).
- Dittami, S. M., Tonon, T. Genomes of extremophile crucifers: New platforms for comparative genomics and beyond. Genome Biology. 13 (8), 166 (2012).
- Amtmann, A. Learning from evolution: Thellungiella generates new knowledge on essential and critical components of abiotic stress tolerance in plants. Molecular Plant. 2 (1), 3-12 (2009).
- Oh, D. -. H., Hong, H., Lee, S. Y., Yun, D. -. J., Bohnert, H. J., Dassanayake, M. Genome structures and transcriptomes signify niche adaptation for the multiple-ion-tolerant extremophyte Schrenkiella parvula. Plant Physiology. 164 (4), 2123-2138 (2014).
- Orsini, F., et al. A comparative study of salt tolerance parameters in 11 wild relatives of Arabidopsis thaliana. Journal of Experimental Botany. 61 (13), 3787-3798 (2010).
- Uzilday, B., Ozgur, R., Sekmen, A. H., Yildiztugay, E., Turkan, I. Changes in the alternative electron sinks and antioxidant defence in chloroplasts of the extreme halophyte Eutrema parvulum (Thellungiella parvula) under salinity. Annals of Botany. 115 (3), 449-463 (2015).
- Teusink, R. S., Rahman, M., Bressan, R. A., Jenks, M. A. Cuticular waxes on Arabidopsis thaliana close relatives Thellungiella halophila and Thellungiella parvula. International Journal of Plant Sciences. 163 (2), 309-315 (2002).
- Jarvis, D. E., Ryu, C. H., Beilstein, M. A., Schumaker, K. S. Distinct roles for SOS1 in the convergent evolution of salt tolerance in Eutrema salsugineum and Schrenkiella parvula. Molecular Biology and Evolution. 31 (8), 2094-2107 (2014).
- Clough, S. J., Bent, A. F. Floral dip: A simplified method for Agrobacterium-mediated transformation of Arabidopsis thaliana. Plant Journal. 16 (6), 735-743 (1998).
- Koornneef, M., Meinke, D. The development of Arabidopsis as a model plant. Plant Journal. 61 (6), 909-921 (2010).
- Bai, J., Wu, F., Mao, Y., He, Y. In planta transformation of Brassica rapa and B. napus via vernalization-infiltration methods. Protocol Exchange. 10, 1028 (2013).
- Sparrow, P. A. C., Goldsack, C. M. P., Østergaard, L. Transformation technology in the Brassicaceae. Genetics and Genomics of the Brassicaceae. , 505-525 (2011).
- Hoagland, D. R., Arnon, D. I. The water-culture method for growing plants without soil. California Agricultural Experiment Station Circular. 347 (347), 1-32 (1950).
- Saiki, R., et al. Primer-directed enzymatic amplification of DNA with a thermostable DNA polymerase. Science. 239 (4839), 487-491 (1988).
- Sun, Y., Sriramajayam, K., Luo, D., Liao, D. J. A Quick, cost-free method of purification of dna fragments from agarose gel. Journal of Cancer. 3, 93-95 (2012).
- Sanger, F., Nicklen, S., Coulson, A. R. DNA sequencing with chain-terminating inhibitors. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 74 (12), 5463-5467 (1977).
- Bertani, G. Studies on Lysogenesis I. The mode of phage liberation by lysogenic Eschericia coli. Journal of Bacteriolgy. 62 (3), 293-300 (1951).
- Koncz, C., Martini, N., Szabados, L., Hrouda, M., Bachmair, A., Schell, J. Specialized vectors for gene tagging and expression studies. Plant Molecular Biology Manual. , 53-74 (1994).
- Weigel, D., Glazebrook, J. Transformation of Agrobacterium using electroporation. Cold Spring Harbor Protocols. 2006 (30), (2006).
- Murray, M. G., Thompson, W. F. Rapid isolation of high molecular weight plant DNA. Nucleic Acids Research. 8 (19), 4321-4326 (1980).
- Inan, G. Salt cress. a halophyte and cryophyte Arabidopsis relative model system and its applicability to molecular genetic analyses of growth and development of extremophiles. Plant Physiol. 135 (3), 1718-1737 (2004).
- Ghedira, R., De Buck, S., Nolf, J., Depicker, A. The efficiency of Arabidopsis thaliana floral dip transformation is determined not only by the Agrobacterium strain used but also by the physiology and the ecotype of the dipped plant. Molecular Plant-Microbe Interactions. 26 (7), 823-832 (2013).
- Shaohong, F. U., Xianya, W. E. I., Yingze, N. I. U., Shixing, G. U. O. Transformation of Brassica napus with the method of floral-dip. Biotechnology: Genomics and Its Applications. , 45-49 (2005).
- Li, J., Tan, X., Zhu, F., Guo, J. A rapid and simple method for Brassica napus floral-dip transformation and selection of transgenic plantlets. International Journal of Biology. 2 (1), 127 (2010).
- Li, H. Q., Xu, J., Chen, L., Li, M. R. Establishment of an efficient Agrobacterium tumefaciens-mediated leaf disc transformation of Thellungiella halophila. Plant Cell Reports. 26 (10), 1785-1789 (2007).
- Wu, G., Rossidivito, G., Hu, T., Berlyand, Y., Poethig, R. S. Traffic lines: New tools for genetic analysis in Arabidopsis thaliana. Genetics. 200 (1), 35-45 (2015).
