Роста и Agrobacterium опосредованной цветочно цинкования трансформации Extremophyte Schrenkiella parvula
Summary
Agrobacterium опосредованной преобразования с помощью метода цветочные цинкования успешно может использоваться для создания стабильной трансгенных линий модели extremophyte Schrenkiella parvula. Мы представляем протокол изменения от того для Arabidopsis thaliana, учитывая различные роста привычки и физиологические характеристики extremophyte.
Abstract
Schrenkiella parvula является extremophyte, адаптированных к различным абиотическим стрессам, включая несколько напряжений токсичности ионов. Несмотря на высокое качество геномных ресурсов для изучения, как растения адаптироваться к окружающей среды подчеркивает ее значение как модель функциональной геномики, и средство было ограничено отсутствием возможности трансформации системы. В этом протоколе, мы приводим как генерировать стабильные трансгенных S. parvula линий, с помощью метода Agrobacterium опосредованной цветочные цинкования. Мы изменили преобразования протокол, используемый для A. thaliana отчитаться за уникальные черты S. parvula, как неопределенный цветения привычку и содержанием высокого epicuticular воска на листьях. Вкратце S. parvula семена были стратифицированы на 4 ° C за 5 дней до посадки. Растения выращивались на Фотопериод свет 14 h и 10 h темно и 130 мкмоль м-2s-1 интенсивности света, при 22 ° C до 24 ° C. Восьми до девяти недельных растений с несколькими соцветий были выбраны для преобразования. Эти соцветий были ближнего в проникновения раствора Agrobacterium tumefaciens GV3101 проведение pMP90RK плазмиды. Мы провели два раунда цветок погружения с интервалом в три-четыре недели для повышения эффективности преобразования. T1 семена были собраны и сушат в течение четырех недель в контейнере с осушители до прорастания экран для кандидата преобразовать линии. Сопротивление BASTA был использован для экрана T1 растений. Мы распылять раствор БАСТА три раза с интервалом в три дня, начиная с двух недельных растений для уменьшения ложных срабатываний. Испытание на падение BASTA была выполнена на сохранившихся отдельных растений, чтобы определить истинный положительный трансформантов. Эффективность преобразования был 0,033%, уступая трансгенных растений 3-4 на 10 000 T1 семена распространяются.
Introduction
В этом протоколе мы описываем, рост и создание стабильных трансгенных линий для модели extremophyte Schrenkiella parvula. Отличительной чертой любой универсальный генетический модели является наличие эффективной трансформации системы. Растения, которые процветают в экстремальных условиях, упоминаемый как extremophytes, обеспечивают жизненно важным ресурсом для понимания адаптации растений к экологическим стрессам. Schrenkiella parvula (ранее Thellungiella parvula и Eutrema parvulum) является одной из таких моделей extremophyte, с расширением геномных ресурсов1,2,3,4,5. Однако протоколы преобразования не пока не поступало для S. parvula в опубликованных исследованиях.
Геном S. parvula Геном первой опубликованной extremophyte в капустные (горчица капуста семьи) и показывает обширную общую генома synteny с не extremophyte модель, Arabidopsis thaliana1. Таким образом сравнительные исследования между A. thaliana и S. parvula выиграют от богатства генетических исследований, выполненных на A. thaliana сделать информативный гипотез о как развивалась и регулируется геном S. parvula по-разному справиться с экстремальных экологических подчеркивает5,6,7. S. parvula является одним из наиболее солевыносливых видов (основанный на почве NaCl LD50) среди известных диких сородичей A. thaliana8. В дополнение к терпимости NaCl S. parvula выживает и завершает свой жизненный цикл в присутствии нескольких соли ионов при высоких концентрациях токсичен для большинства растений7. В ответ к абиотическим стрессам, распространенных в своей естественной среде обитания она развивалась различные черты, среди которых несколько учился в биохимических и физиологических уровня 8,9,10, 11.
С 2010 года были более 400 публикаций сверстников reveiwed, которые использованы S. parvula как вид целевого или использовать его в сравнении с другими геномов растений. Однако ясно узким местом может быть отождествлен с пристальный взгляд какой тип исследований были проведены. Большинство этих сообщений обсуждают потенциальное использование S. parvula в будущих исследованиях или использовать его в сравнительной геномной или phylogenomic исследований. Из-за отсутствия доказательства в концепция преобразования протокола создана для S. parvula, он не был использован в функциональных геномных исследований, несмотря на то, что один из высокого качества завода геномов имеющейся на сегодняшний день (> 5 МБ contig N50) собрал и заметки в pseudomolecules хромосомы уровня1.
Agrobacterium опосредованной цветочные цинкования преобразования метод стал наиболее широко используемым методом для создания trasngenic линий в A. thalianaи развитие воспроизводимые системы трансформации было решающим фактором ее успеха как генетическая модель12,13. Однако не все виды капустные было показано, быть успешно преобразованы с помощью метода цветочные цинкования, разработанные для A. thaliana. Специально капустные Lineage II виды, которые включают S. parvula был непокорным цветочные цинкования на основе преобразования методов14,15.
Привычка роста неопределенного цветения S. parvula, в сочетании с его узкие листья морфология сделала сложно принять стандартный Agrobacterium опосредованной цветочные цинкования трансформации метода. В этом исследовании мы приводим измененный Протокол, который мы разработали для воспроизводимых трансформации S. parvula.
Protocol
Representative Results
Discussion
Физиологическое состояние растений значительно влияет на эффективность преобразования25. Использование растений, здоровым и энергичным для трансформации является одним из ключевых требований для успешной трансформации в S. parvula. Воды или света подчеркнул растений бу…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Эта работа была поддержана Национальный научный фонд премии MCB 1616827.
Materials
| Agar | VWR International, Radnor, PA | 90000-762 | Bacto Agar Soldifying Agent, BD Diagnostics |
| B5 vitamins | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO | G1019 | Gamborg’s Vitamin Solution |
| Desiccant | W A Hammond Drierite, Xenia, OH | 22005 | Indicating DRIERITE 6 mesh |
| Destination vector for plant transformation | TAIR | Vector:6531113857 | pKGWFS7 |
| Electroporation cuvette | USA Scientific | 9104-5050 | Electroporation cuvette, round cap, 0.2 cm gap |
| Electroporator | BIO-RAD Laboratories, Hercules, CA | 1652100 | MicroPulser Electroporator |
| Fertilizer beads | Osmocote Garden, Marysville, OH | N/A | Osmocote Smart-Release Plant Food Flower & Vegetable |
| Gel extraction kit | iNtRON Biotechnology, Boston, MA | 17289 | MEGAquick-spin Total fragment DNA purification kit |
| Gentamicin | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO | G1914-5G | Gentamicin sulfate |
| Glufosinate-ammonium (11.3%) herbicide (BASTA) | Bayer environmental science, Montvale, NJ | N/A | FINALE herbicide |
| Kanamycin | VWR International, Radnor, PA | 200004-444 | Kanamycin monosulfate |
| MES | Bioworld, Dublin, OH | 41320024-2 | MES, Free Acid |
| MS salt | MP Biomedicals, Santa Anna, CA | 092621822 | Hoagland's modified basal salt mixture |
| N6-benzylaminopurine (BA) | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO | B3274 | 6-Benzylaminopurine solution |
| NaCl | Sigma-Alrich | S7653 | Sodium chloride |
| Non-ionic detergent | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO | 9005-64-5 | TWEEN 20 |
| Plasmid isolation kit | Zymo Research, Irvine, CA | D4036 | Zyppy Plasmid Kits |
| Recombinase enzyme mix kit | Life Technology | 11791-020 | Gateway LR Clonase II Enzyme mix |
| Rifampicin | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO | R3501-1G | Rifampicin, powder, >= 97% (HPLC) |
| Shaking incubator | ThermoFisher Scientific, Waltham, MA | SHKE4450 | MaxQ 4450 Benchtop Orbital Shakers |
| Soil mix | Sun Gro | SUN239223328CFLP | Sun Gro Metro-Mix 360 Grower Mix |
| Spectinomycin | VWR International, Radnor, PA | IC15206705 | |
| Sterile 50ml conical tubes | USA Scientific, Ocala, FL | 1500-1811 | 50 ml conical screw cap tubes, copolymer, racks, sterile |
| Sucrose | VWR International, Radnor, PA | 57-50-1 | Sucrose, ACS |
| Surfactant solution | Lehle seeds, Round Rock, TX | VIS-02 | Silwet L-77 |
| Topoisomerase-based cloning kit | Life Technologies, Carlsbad, CA | K240020 | pENTR/D-TOPO Cloning Kit, with One Shot TOP10 Chemically Competent E. coli |
| Tryptone | VWR International, Radnor, PA | 90000-282 | BD Bacto Tryptone, BD Biosciences |
| Yeast Extract | VWR International, Radnor, PA | 90000-722 | BD Bacto Yeast Extract, BD Biosciences |
References
- Dassanayake, M., et al. The genome of the extremophile crucifer Thellungiella parvula. Nature Genetics. 43 (9), 913-918 (2011).
- Oh, D. -. H., Dassanayake, M., Bohnert, H. J., Cheeseman, J. M. Life at the extreme: lessons from the genome. Genome Biology. 13 (3), 241 (2012).
- Whited, J. The Next Top Models. Cell. 163 (1), 18-20 (2015).
- Dassanayake, M., Yun, D. O. D., Bressan, R. A., Cheeseman, J. M., Bohnert, J. H. The scope of things to come: New paradigms in biotechnology. Plant Biotechnology and Agriculture: Prospects for the 21st Century. , 19-34 (2009).
- Dittami, S. M., Tonon, T. Genomes of extremophile crucifers: New platforms for comparative genomics and beyond. Genome Biology. 13 (8), 166 (2012).
- Amtmann, A. Learning from evolution: Thellungiella generates new knowledge on essential and critical components of abiotic stress tolerance in plants. Molecular Plant. 2 (1), 3-12 (2009).
- Oh, D. -. H., Hong, H., Lee, S. Y., Yun, D. -. J., Bohnert, H. J., Dassanayake, M. Genome structures and transcriptomes signify niche adaptation for the multiple-ion-tolerant extremophyte Schrenkiella parvula. Plant Physiology. 164 (4), 2123-2138 (2014).
- Orsini, F., et al. A comparative study of salt tolerance parameters in 11 wild relatives of Arabidopsis thaliana. Journal of Experimental Botany. 61 (13), 3787-3798 (2010).
- Uzilday, B., Ozgur, R., Sekmen, A. H., Yildiztugay, E., Turkan, I. Changes in the alternative electron sinks and antioxidant defence in chloroplasts of the extreme halophyte Eutrema parvulum (Thellungiella parvula) under salinity. Annals of Botany. 115 (3), 449-463 (2015).
- Teusink, R. S., Rahman, M., Bressan, R. A., Jenks, M. A. Cuticular waxes on Arabidopsis thaliana close relatives Thellungiella halophila and Thellungiella parvula. International Journal of Plant Sciences. 163 (2), 309-315 (2002).
- Jarvis, D. E., Ryu, C. H., Beilstein, M. A., Schumaker, K. S. Distinct roles for SOS1 in the convergent evolution of salt tolerance in Eutrema salsugineum and Schrenkiella parvula. Molecular Biology and Evolution. 31 (8), 2094-2107 (2014).
- Clough, S. J., Bent, A. F. Floral dip: A simplified method for Agrobacterium-mediated transformation of Arabidopsis thaliana. Plant Journal. 16 (6), 735-743 (1998).
- Koornneef, M., Meinke, D. The development of Arabidopsis as a model plant. Plant Journal. 61 (6), 909-921 (2010).
- Bai, J., Wu, F., Mao, Y., He, Y. In planta transformation of Brassica rapa and B. napus via vernalization-infiltration methods. Protocol Exchange. 10, 1028 (2013).
- Sparrow, P. A. C., Goldsack, C. M. P., Østergaard, L. Transformation technology in the Brassicaceae. Genetics and Genomics of the Brassicaceae. , 505-525 (2011).
- Hoagland, D. R., Arnon, D. I. The water-culture method for growing plants without soil. California Agricultural Experiment Station Circular. 347 (347), 1-32 (1950).
- Saiki, R., et al. Primer-directed enzymatic amplification of DNA with a thermostable DNA polymerase. Science. 239 (4839), 487-491 (1988).
- Sun, Y., Sriramajayam, K., Luo, D., Liao, D. J. A Quick, cost-free method of purification of dna fragments from agarose gel. Journal of Cancer. 3, 93-95 (2012).
- Sanger, F., Nicklen, S., Coulson, A. R. DNA sequencing with chain-terminating inhibitors. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 74 (12), 5463-5467 (1977).
- Bertani, G. Studies on Lysogenesis I. The mode of phage liberation by lysogenic Eschericia coli. Journal of Bacteriolgy. 62 (3), 293-300 (1951).
- Koncz, C., Martini, N., Szabados, L., Hrouda, M., Bachmair, A., Schell, J. Specialized vectors for gene tagging and expression studies. Plant Molecular Biology Manual. , 53-74 (1994).
- Weigel, D., Glazebrook, J. Transformation of Agrobacterium using electroporation. Cold Spring Harbor Protocols. 2006 (30), (2006).
- Murray, M. G., Thompson, W. F. Rapid isolation of high molecular weight plant DNA. Nucleic Acids Research. 8 (19), 4321-4326 (1980).
- Inan, G. Salt cress. a halophyte and cryophyte Arabidopsis relative model system and its applicability to molecular genetic analyses of growth and development of extremophiles. Plant Physiol. 135 (3), 1718-1737 (2004).
- Ghedira, R., De Buck, S., Nolf, J., Depicker, A. The efficiency of Arabidopsis thaliana floral dip transformation is determined not only by the Agrobacterium strain used but also by the physiology and the ecotype of the dipped plant. Molecular Plant-Microbe Interactions. 26 (7), 823-832 (2013).
- Shaohong, F. U., Xianya, W. E. I., Yingze, N. I. U., Shixing, G. U. O. Transformation of Brassica napus with the method of floral-dip. Biotechnology: Genomics and Its Applications. , 45-49 (2005).
- Li, J., Tan, X., Zhu, F., Guo, J. A rapid and simple method for Brassica napus floral-dip transformation and selection of transgenic plantlets. International Journal of Biology. 2 (1), 127 (2010).
- Li, H. Q., Xu, J., Chen, L., Li, M. R. Establishment of an efficient Agrobacterium tumefaciens-mediated leaf disc transformation of Thellungiella halophila. Plant Cell Reports. 26 (10), 1785-1789 (2007).
- Wu, G., Rossidivito, G., Hu, T., Berlyand, Y., Poethig, R. S. Traffic lines: New tools for genetic analysis in Arabidopsis thaliana. Genetics. 200 (1), 35-45 (2015).
