Croissance des plantes et la Transformation par Agrobacterium Floral creux de la Extremophyte Schrenkiella parvula
Summary
La transformation par Agrobacterium en utilisant une méthode floral creux peut être employée avec succès pour créer des lignées transgéniques stables du modèle extremophyte Schrenkiella parvula. Nous présentons un protocole modifié de celui d’ Arabidopsis thaliana, compte tenu des habitudes de croissance différent et les caractéristiques physiologiques de l’extremophyte.
Abstract
Schrenkiella parvula est une extremophyte adaptée aux différents stress abiotiques, y compris les multiples contraintes de la toxicité d’ion. Malgré la qualité des ressources génomiques disponibles pour étudier comment les plantes s’adaptent à l’environnement souligne, sa valeur comme un modèle de génomique fonctionnelle et outil ont été limité par l’absence d’un système de transformation possible. Dans ce protocole, nous rapportons comment générer transgéniques stable S. parvula lignes en utilisant une méthode d’immersion à floral par Agrobacterium. Nous avons modifié le protocole de transformation utilisé pour a. thaliana pour tenir compte des caractéristiques uniques du S. parvula, comme une habitude de floraison pour une période indéterminée et une teneur en cires épicuticulaire élevé sur les feuilles. En bref, S. parvula graines ont été stratifiées à 4 ° C pendant cinq jours avant la plantation. Les plantes ont été cultivées à une photopériode d’une lumière de 14 h et 10 h d’obscurité et une 130 µmol m-2s-1 intensité lumineuse, à 22 ° C à 24 ° C. Huit à neuf semaines plantes avec plusieurs inflorescences ont été sélectionnés pour la transformation. Ces inflorescences sont trempés dans une solution d’infiltration d’Agrobacterium tumefaciens GV3101 portant le plasmide pMP90RK . Nous avons effectué deux séries de fleur plongeant avec un intervalle de trois à quatre semaines pour augmenter l’efficacité de la transformation. Les graines de T1 ont été recueillies et séchées pendant quatre semaines dans un récipient avec gel de silice avant la germination pour dépister le candidat transformé lignes. Résistance aux BASTA a été utilisée pour dépister les plantes T1. Nous avons pulvérisé la solution BASTA trois fois avec un intervalle de trois jours à partir de deux semaines centrales pour réduire les faux positifs. Une épreuve de chute BASTA a été réalisée sur la survie des plantes individuelles afin d’identifier les vrais positifs transformants. L’efficacité de la transformation a été 0,033 %, ce qui donne des plantes transgéniques de 3 – 4 10 000 graines T1 propagées.
Introduction
Dans ce protocole, nous décrivons la croissance et la création de lignées transgéniques stables pour le modèle extremophyte Schrenkiella parvula. La disponibilité d’un système efficace de transformation est une caractéristique de n’importe quel modèle génétique polyvalent. Plantes qui se développent dans des environnements extrêmes, mentionné comme extremophytes, fournissent une ressource cruciale pour comprendre les adaptations des plantes aux stress environnementaux. Schrenkiella parvula (anciennement Thellungiella parvula et Eutrema parvula) est un tel modèle extremophyte, avec l’expansion des ressources génomiques1,2,3,4,5. Toutefois, des protocoles de transformation n’ont pas encore été signalées pour S. parvula études publiées.
Le génome de S. parvula est le premier génome d’extremophyte publiés dans Brassicaceae (famille de la moutarde-chou) et montre une vaste synténie du génome globale avec le modèle non-extremophyte, Arabidopsis thaliana1. Ainsi, des études comparatives entre a. thaliana et S. parvula pourraient bénéficier de la richesse des études génétiques effectuées sur a. thaliana , faire des hypothèses informatives sur comment le génome de s. parvula a évolué et réglementé différemment pour faire face aux extrêmes environnementaux souligne5,6,7. S. parvula est une des espèces plus tolérantes au sel (basés sur sol NaCl LD50) parmi les parents sauvages connues d’a. thaliana8. En plus de la tolérance de NaCl, S. parvula survit et termine son cycle de vie en présence de plusieurs ions salins à de fortes concentrations de toxiques pour la plupart de plantes7. En réponse aux stress abiotiques dans son habitat naturel, il a évolué des traits différents, parmi lesquels plusieurs ont été étudiés à la biochimiques ou physiologiques niveau 8,9,10, 11.
Depuis 2010, ont été plus de 400 publications peer-reveiwed utilisé S. parvula comme espèce cible ou utilisèrent dans une comparaison avec d’autres génomes de plantes. Toutefois, un goulot d’étranglement clair pourrait être identifié avec un examen approfondi de ce type d’études ont été menées. La majorité de ces rapports discute l’utilisation potentielle de S. parvula dans de futures études ou l’utilise dans la génomique comparative ou études de phylogenomic. En raison de l’absence d’un protocole de validation de la transformation établie pour S. parvula, il n’a pas été utilisé dans les études de génomique fonctionnelles, malgré avoir un des plus hautes génomes de plantes de qualité disponibles à ce jour (> 5 Mo contig N50) assemblés et annoté en pseudomolécules au niveau du chromosome1.
La méthode de la transformation par Agrobacterium floral creux est devenue la méthode la plus largement utilisée pour créer des lignes de trasngenic dans Arabidopsis, et l’élaboration d’un système reproductible de transformation a été un facteur essentiel à son succès comme un modèle génétique12,13. Cependant, pas toutes les espèces de Brassicaceae ont démontré être transformée avec succès en utilisant la méthode floral creux mis au point pour a. thaliana. Spécialement, les espèces de Brassicaceae Lineage II qui incluent S. parvula a été récalcitrant à floral creux transformation fonction méthodes14,15.
L’habitude de croissance floraison pour une période indéterminée de S. parvula, combinée à sa morphologie de feuille étroite rend difficile d’adopter la méthode de transformation de floral creux standard par Agrobacterium. Dans cette étude, nous présentons le protocole modifié, que nous avons développé pour transformation reproductible de S. parvula.
Protocol
Representative Results
Discussion
L’état physiologique de la plante influence significativement l’efficacité de transformation25. L’utilisation de plants sains et vigoureux pour transformation est une condition essentielle pour la réussite de la transformation en S. parvula. L’eau ou lumière des plantes stressées auront moins de fleurs par rapport à l’idéal de transformation (Figure 1, panneau central) des plantes saines. S. parvula peuvent pousser à une intensité …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Ce travail a été soutenu par une bourse de la National Science Foundation 1616827 MCB.
Materials
| Agar | VWR International, Radnor, PA | 90000-762 | Bacto Agar Soldifying Agent, BD Diagnostics |
| B5 vitamins | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO | G1019 | Gamborg’s Vitamin Solution |
| Desiccant | W A Hammond Drierite, Xenia, OH | 22005 | Indicating DRIERITE 6 mesh |
| Destination vector for plant transformation | TAIR | Vector:6531113857 | pKGWFS7 |
| Electroporation cuvette | USA Scientific | 9104-5050 | Electroporation cuvette, round cap, 0.2 cm gap |
| Electroporator | BIO-RAD Laboratories, Hercules, CA | 1652100 | MicroPulser Electroporator |
| Fertilizer beads | Osmocote Garden, Marysville, OH | N/A | Osmocote Smart-Release Plant Food Flower & Vegetable |
| Gel extraction kit | iNtRON Biotechnology, Boston, MA | 17289 | MEGAquick-spin Total fragment DNA purification kit |
| Gentamicin | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO | G1914-5G | Gentamicin sulfate |
| Glufosinate-ammonium (11.3%) herbicide (BASTA) | Bayer environmental science, Montvale, NJ | N/A | FINALE herbicide |
| Kanamycin | VWR International, Radnor, PA | 200004-444 | Kanamycin monosulfate |
| MES | Bioworld, Dublin, OH | 41320024-2 | MES, Free Acid |
| MS salt | MP Biomedicals, Santa Anna, CA | 092621822 | Hoagland's modified basal salt mixture |
| N6-benzylaminopurine (BA) | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO | B3274 | 6-Benzylaminopurine solution |
| NaCl | Sigma-Alrich | S7653 | Sodium chloride |
| Non-ionic detergent | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO | 9005-64-5 | TWEEN 20 |
| Plasmid isolation kit | Zymo Research, Irvine, CA | D4036 | Zyppy Plasmid Kits |
| Recombinase enzyme mix kit | Life Technology | 11791-020 | Gateway LR Clonase II Enzyme mix |
| Rifampicin | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO | R3501-1G | Rifampicin, powder, >= 97% (HPLC) |
| Shaking incubator | ThermoFisher Scientific, Waltham, MA | SHKE4450 | MaxQ 4450 Benchtop Orbital Shakers |
| Soil mix | Sun Gro | SUN239223328CFLP | Sun Gro Metro-Mix 360 Grower Mix |
| Spectinomycin | VWR International, Radnor, PA | IC15206705 | |
| Sterile 50ml conical tubes | USA Scientific, Ocala, FL | 1500-1811 | 50 ml conical screw cap tubes, copolymer, racks, sterile |
| Sucrose | VWR International, Radnor, PA | 57-50-1 | Sucrose, ACS |
| Surfactant solution | Lehle seeds, Round Rock, TX | VIS-02 | Silwet L-77 |
| Topoisomerase-based cloning kit | Life Technologies, Carlsbad, CA | K240020 | pENTR/D-TOPO Cloning Kit, with One Shot TOP10 Chemically Competent E. coli |
| Tryptone | VWR International, Radnor, PA | 90000-282 | BD Bacto Tryptone, BD Biosciences |
| Yeast Extract | VWR International, Radnor, PA | 90000-722 | BD Bacto Yeast Extract, BD Biosciences |
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