Summary

צמח צמיחה ושינוי בתיווך Agrobacterium פרחוני-מח ש של Extremophyte Schrenkiella parvula

Published: January 07, 2019
doi:

Summary

שינוי בתיווך Agrobacterium באמצעות שיטת פרחוני-מח ש יכול להיות מועסק בהצלחה כדי ליצור שורות הטרנסגניים יציב של המודל extremophyte Schrenkiella parvula. אנו מציגים פרוטוקול שונה מזו עבור תודרנית לבנה, בהתחשב גידול שונים והרגלי הפיזיולוגיות של extremophyte.

Abstract

Schrenkiella parvula הוא extremophyte הותאם מושם והאביוטיים שונים, כולל לחצים רעילות יון מרובים. למרות באיכות גבוהה גנומית המשאבים הזמינים כדי ללמוד איך הצמחים להתאים הסביבה מדגיש, ערכו כמודל גנומיקה תפקודית, כלי הגביל היעדרה של מערכת שינוי ריאלי. ב פרוטוקול זה, אנחנו לדווח על איך ליצור יציבה הטרנסגניים ס parvula קווים באמצעות שיטת פרחוני-מח ש בתיווך Agrobacterium. לשנות את פרוטוקול טרנספורמציה המשמש לבנה א עבור התכונות הייחודיות של S. parvula, כגון של הרגל פריחה ייווצרו ותוכן שעווה epicuticular גבוהה על עלים. בקצרה, ס parvula זרעים היו מרובדת ב 4 מעלות צלזיוס למשך חמישה ימים לפני השתילה. הצמחים גדלו ב- photoperiod אור 14 h ואת כהה 10שע 130 µmol מ’-2s-1 עוצמת אור, ב- 22 ° C עד 24 ° C. 8-9 צמחים בת שבוע עם התפרחות מרובות נבחרו לשינוי. התפרחות אלה היו טבולים ב פתרון חדירה של Agrobacterium tumefaciens GV3101, נושאת את פלסמיד pMP90RK . ביצענו שני סיבובים של פרח טובלים במרווח של 3-4 שבועות כדי להגביר את היעילות טרנספורמציה. הזרעים T1 היו נאספים, יבשים במשך ארבעה שבועות במיכל עם desiccants לפני הנביטה עבור המועמד מסך טרנספורמציה קווים. התנגדות באסטה שימש למסך T1 צמחים. ריססנו את הפתרון באסטה שלוש פעמים במרווח של שלושה ימים, החל מ- שני צמחים בת שבוע כדי לצמצם את תוצאות חיוביות שגויות. מבחן טיפה באסטה בוצעה ב ששרדו צמחים בודדים כדי לזהות נכון transformants חיובי. היעילות השינוי היה 0.033%, מניב 3-4 הצמחים הטרנסגניים לכל 10,000 זרעים T1 מופצות.

Introduction

ב פרוטוקול זה, אנו מתארים את הצמיחה ואת הקמת קווי הטרנסגניים יציבה עבור דגם extremophyte Schrenkiella parvula. הזמינות של מערכת יעילה השינוי מהווה סימן היכר של כל דגם גנטי רב תכליתי. צמחים לשגשג בסביבות קיצוניות, התייחס כמו extremophytes, לספק משאב קריטי להבנת צמח עיבודים מושם סביבתיים. Schrenkiella parvula (לשעבר Thellungiella parvula , Eutrema parvulum) הוא אחד דגם extremophyte כזה, עם הרחבת משאבי גנומית1,2,3,4,5. עם זאת, השינוי פרוטוקולים לא עדיין דווחו עבור ס parvula במחקרים שפורסמו.

הגנום של parvula ס הוא הגנום extremophyte שפורסמו הראשון ב מצליבים (חרדל-כרוב משפחה) ומראה של synteny גנום הכוללת נרחב עם המודל הלא-extremophyte, תודרנית לבנה1. לכן, מחקרים השוואתיים בין לבנה א ס parvula יכול להפיק תועלת העושר של מחקרים גנטיים מתבצע על לבנה א לעשות השערות אינפורמטיבי על איך הגנום S. parvula יש התפתחו ומוסדרת אחרת להתמודד עם קיצוני סביבתי מדגיש5,6,7. ס parvula היא אחת ביותר מלח-סובלנית מינים (מבוסס על אדמת NaCl LD50) בין קרובי משפחה פראי ידועה של לבנה א8. בנוסף הסובלנות NaCl, ס parvula שורד, משלים את מחזור החיים שלו בנוכחות יונים מרובים מלח בריכוזים גבוהים רעיל צמחים רוב7. בתגובה הלחצים והאביוטיים שכיחה בבית גידולו הטבעי, זה התפתח תכונות שונות, ביניהם כמה נחקרו ביוכימית או פיזיולוגיים רמה 8,9,10, 11.

מאז 2010, היו מעל 400 פרסומים עמיתים-reveiwed ס parvula כמין היעד או השתמש בה השוואה עם הגנום צמחים אחרים. עם זאת, צוואר בקבוק ברור יכול להיות מזוהה עם מבט מקרוב של איזה סוג של מחקרים נערכו. הרוב המכריע של דוחות אלה לדבר על פוטנציאל השימוש parvula ס במחקרים עתידיים או להשתמש בו השוואתי גנומית או לימודים phylogenomic. בגלל העדר פרוטוקול הוכחה הרעיון טרנספורמציה הוקמה עבור S. parvula, זה לא נעשה שימוש במחקרים גנומית פונקציונלי, למרות שיש לאחד הגנומים הצמח באיכות הגבוהה ביותר זמין עד כה (> 5 מגהבייט contig N50) התאספו ו מבואר pseudomolecules ברמת כרומוזום1.

השיטה בתיווך Agrobacterium טרנספורמציה פרחוני-מח ש הפך השיטה באופן כללי ביותר בשימוש כדי ליצור קווים trasngenic לבנה א, הפיתוח של מערכת לשחזור של השינוי היה גורם קריטי להצלחתו בתור מודל גנטי12,13. עם זאת, לא כל המינים מצליבים הוכחו להיהפך בהצלחה באמצעות השיטה פרחוני-מח ש שפותחו עבור לבנה א. . במיוחד, המין השני לשושלת מצליבים הכוללים parvula ס כבר הסרבן פרחוני-מח ש טרנספורמציה המבוססת על שיטות14,15.

ההרגל צמיחה פריחה ייווצרו ס parvula, בשילוב עם מורפולוגיה עלים צרים שלה עשה את זה מאתגר לאמץ את השיטה טרנספורמציה פרחוני-מח ש בתיווך Agrobacterium רגיל. במחקר זה, אנו מדווחים על פרוטוקול ששונה שפיתחנו לשינוי לשחזור ס parvula.

Protocol

1. צימוח עיקור זרע (אופציונלי) להכין 50% מלבין מזוקק פעמיים מים (ddH2O) עם 1 או 2 טיפות של חומר ניקוי ללא יונית (ראה טבלה של חומרים) צינור 50 מ ל. היפוך ברכבת התחתית מספר פעמים כדי לערבב את הפתרון.הערה: עדיף לבצע עיקור זרע בזרימה שכבתית ארון עם משטח סטירי…

Representative Results

פיתחנו פרוטוקול טרנספורמציה המאפשרת קציר של T0 זרעים בתוך 150 ימים, באמצעות שיטה פרחוני-מח ש שונה מזו עבור לבנה א. איור 1 מציג סיכום של ציר זמן, ס parvula צמחים המייצגים את הבמה אופטימלית עבור ביצוע השינוי דרך פרחוני-מח ש. בחרנו ס parvula צמחים עם …

Discussion

מצב פיזיולוגי של הצמח משפיע באופן משמעותי את היעילות של טרנספורמציה25. שימוש בצמחים בריא וחסון לשינוי היא דרישה מרכזית לשינוי מוצלח ב ס parvula. מים או צמחים הדגיש האור יהיה פחות פרחים לעומת הצמחים בריא אידיאלי עבור טרנספורמציה (איור 1, במרכז החלונית). Parvula ס …

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

עבודה זו נתמכה על ידי פרס הלאומית למדע MCB 1616827.

Materials

Agar VWR International, Radnor, PA 90000-762 Bacto Agar Soldifying Agent, BD Diagnostics
B5 vitamins Sigma-Aldrich, St. Louis, MO G1019 Gamborg’s Vitamin Solution
Desiccant W A Hammond Drierite, Xenia, OH 22005 Indicating DRIERITE 6 mesh
Destination vector for plant transformation TAIR Vector:6531113857 pKGWFS7
Electroporation cuvette USA Scientific 9104-5050 Electroporation cuvette, round cap, 0.2 cm gap
Electroporator BIO-RAD Laboratories, Hercules, CA 1652100 MicroPulser Electroporator
Fertilizer beads Osmocote Garden, Marysville, OH N/A Osmocote Smart-Release Plant Food Flower & Vegetable
Gel extraction kit iNtRON Biotechnology, Boston, MA 17289 MEGAquick-spin Total fragment DNA purification kit
Gentamicin Sigma-Aldrich, St. Louis, MO G1914-5G Gentamicin sulfate
Glufosinate-ammonium (11.3%) herbicide (BASTA) Bayer environmental science, Montvale, NJ N/A FINALE herbicide
Kanamycin VWR International, Radnor, PA 200004-444 Kanamycin monosulfate
MES Bioworld, Dublin, OH 41320024-2 MES, Free Acid
MS salt MP Biomedicals, Santa Anna, CA 092621822 Hoagland's modified basal salt mixture
N6-benzylaminopurine (BA)  Sigma-Aldrich, St. Louis, MO B3274 6-Benzylaminopurine solution
NaCl Sigma-Alrich S7653 Sodium chloride
Non-ionic detergent Sigma-Aldrich, St. Louis, MO 9005-64-5 TWEEN 20 
Plasmid isolation kit Zymo Research, Irvine, CA D4036 Zyppy Plasmid Kits
Recombinase enzyme mix kit Life Technology 11791-020 Gateway LR Clonase II Enzyme mix
Rifampicin Sigma-Aldrich, St. Louis, MO R3501-1G Rifampicin, powder, >= 97% (HPLC)
Shaking incubator ThermoFisher Scientific, Waltham, MA SHKE4450 MaxQ 4450 Benchtop Orbital Shakers
Soil mix Sun Gro SUN239223328CFLP Sun Gro Metro-Mix 360 Grower Mix
Spectinomycin VWR International, Radnor, PA IC15206705
Sterile 50ml conical tubes USA Scientific, Ocala, FL 1500-1811 50 ml conical screw cap tubes, copolymer, racks, sterile
Sucrose VWR International, Radnor, PA 57-50-1 Sucrose, ACS
Surfactant solution Lehle seeds, Round Rock, TX VIS-02 Silwet L-77
Topoisomerase-based cloning kit Life Technologies, Carlsbad, CA K240020 pENTR/D-TOPO Cloning Kit, with One Shot TOP10 Chemically Competent E. coli
Tryptone VWR International, Radnor, PA 90000-282 BD Bacto Tryptone, BD Biosciences
Yeast Extract VWR International, Radnor, PA 90000-722  BD Bacto Yeast Extract, BD Biosciences

References

  1. Dassanayake, M., et al. The genome of the extremophile crucifer Thellungiella parvula. Nature Genetics. 43 (9), 913-918 (2011).
  2. Oh, D. -. H., Dassanayake, M., Bohnert, H. J., Cheeseman, J. M. Life at the extreme: lessons from the genome. Genome Biology. 13 (3), 241 (2012).
  3. Whited, J. The Next Top Models. Cell. 163 (1), 18-20 (2015).
  4. Dassanayake, M., Yun, D. O. D., Bressan, R. A., Cheeseman, J. M., Bohnert, J. H. The scope of things to come: New paradigms in biotechnology. Plant Biotechnology and Agriculture: Prospects for the 21st Century. , 19-34 (2009).
  5. Dittami, S. M., Tonon, T. Genomes of extremophile crucifers: New platforms for comparative genomics and beyond. Genome Biology. 13 (8), 166 (2012).
  6. Amtmann, A. Learning from evolution: Thellungiella generates new knowledge on essential and critical components of abiotic stress tolerance in plants. Molecular Plant. 2 (1), 3-12 (2009).
  7. Oh, D. -. H., Hong, H., Lee, S. Y., Yun, D. -. J., Bohnert, H. J., Dassanayake, M. Genome structures and transcriptomes signify niche adaptation for the multiple-ion-tolerant extremophyte Schrenkiella parvula. Plant Physiology. 164 (4), 2123-2138 (2014).
  8. Orsini, F., et al. A comparative study of salt tolerance parameters in 11 wild relatives of Arabidopsis thaliana. Journal of Experimental Botany. 61 (13), 3787-3798 (2010).
  9. Uzilday, B., Ozgur, R., Sekmen, A. H., Yildiztugay, E., Turkan, I. Changes in the alternative electron sinks and antioxidant defence in chloroplasts of the extreme halophyte Eutrema parvulum (Thellungiella parvula) under salinity. Annals of Botany. 115 (3), 449-463 (2015).
  10. Teusink, R. S., Rahman, M., Bressan, R. A., Jenks, M. A. Cuticular waxes on Arabidopsis thaliana close relatives Thellungiella halophila and Thellungiella parvula. International Journal of Plant Sciences. 163 (2), 309-315 (2002).
  11. Jarvis, D. E., Ryu, C. H., Beilstein, M. A., Schumaker, K. S. Distinct roles for SOS1 in the convergent evolution of salt tolerance in Eutrema salsugineum and Schrenkiella parvula. Molecular Biology and Evolution. 31 (8), 2094-2107 (2014).
  12. Clough, S. J., Bent, A. F. Floral dip: A simplified method for Agrobacterium-mediated transformation of Arabidopsis thaliana. Plant Journal. 16 (6), 735-743 (1998).
  13. Koornneef, M., Meinke, D. The development of Arabidopsis as a model plant. Plant Journal. 61 (6), 909-921 (2010).
  14. Bai, J., Wu, F., Mao, Y., He, Y. In planta transformation of Brassica rapa and B. napus via vernalization-infiltration methods. Protocol Exchange. 10, 1028 (2013).
  15. Sparrow, P. A. C., Goldsack, C. M. P., Østergaard, L. Transformation technology in the Brassicaceae. Genetics and Genomics of the Brassicaceae. , 505-525 (2011).
  16. Hoagland, D. R., Arnon, D. I. The water-culture method for growing plants without soil. California Agricultural Experiment Station Circular. 347 (347), 1-32 (1950).
  17. Saiki, R., et al. Primer-directed enzymatic amplification of DNA with a thermostable DNA polymerase. Science. 239 (4839), 487-491 (1988).
  18. Sun, Y., Sriramajayam, K., Luo, D., Liao, D. J. A Quick, cost-free method of purification of dna fragments from agarose gel. Journal of Cancer. 3, 93-95 (2012).
  19. Sanger, F., Nicklen, S., Coulson, A. R. DNA sequencing with chain-terminating inhibitors. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 74 (12), 5463-5467 (1977).
  20. Bertani, G. Studies on Lysogenesis I. The mode of phage liberation by lysogenic Eschericia coli. Journal of Bacteriolgy. 62 (3), 293-300 (1951).
  21. Koncz, C., Martini, N., Szabados, L., Hrouda, M., Bachmair, A., Schell, J. Specialized vectors for gene tagging and expression studies. Plant Molecular Biology Manual. , 53-74 (1994).
  22. Weigel, D., Glazebrook, J. Transformation of Agrobacterium using electroporation. Cold Spring Harbor Protocols. 2006 (30), (2006).
  23. Murray, M. G., Thompson, W. F. Rapid isolation of high molecular weight plant DNA. Nucleic Acids Research. 8 (19), 4321-4326 (1980).
  24. Inan, G. Salt cress. a halophyte and cryophyte Arabidopsis relative model system and its applicability to molecular genetic analyses of growth and development of extremophiles. Plant Physiol. 135 (3), 1718-1737 (2004).
  25. Ghedira, R., De Buck, S., Nolf, J., Depicker, A. The efficiency of Arabidopsis thaliana floral dip transformation is determined not only by the Agrobacterium strain used but also by the physiology and the ecotype of the dipped plant. Molecular Plant-Microbe Interactions. 26 (7), 823-832 (2013).
  26. Shaohong, F. U., Xianya, W. E. I., Yingze, N. I. U., Shixing, G. U. O. Transformation of Brassica napus with the method of floral-dip. Biotechnology: Genomics and Its Applications. , 45-49 (2005).
  27. Li, J., Tan, X., Zhu, F., Guo, J. A rapid and simple method for Brassica napus floral-dip transformation and selection of transgenic plantlets. International Journal of Biology. 2 (1), 127 (2010).
  28. Li, H. Q., Xu, J., Chen, L., Li, M. R. Establishment of an efficient Agrobacterium tumefaciens-mediated leaf disc transformation of Thellungiella halophila. Plant Cell Reports. 26 (10), 1785-1789 (2007).
  29. Wu, G., Rossidivito, G., Hu, T., Berlyand, Y., Poethig, R. S. Traffic lines: New tools for genetic analysis in Arabidopsis thaliana. Genetics. 200 (1), 35-45 (2015).

Play Video

Cite This Article
Wang, G., Pantha, P., Tran, K., Oh, D., Dassanayake, M. Plant Growth and Agrobacterium-mediated Floral-dip Transformation of the Extremophyte Schrenkiella parvula. J. Vis. Exp. (143), e58544, doi:10.3791/58544 (2019).

View Video