作物の生長と花ディップ アグロバクテリウム Extremophyte Schrenkiella parvulaの
Summary
花 dip 法を用いたアグロバクテリウム仲介された変形は extremophyte モデルSchrenkiella parvulaの安定形質転換線を作成する正常に用いることができます。シロイヌナズナ、別の成長の習慣と、extremophyte の生理学的特性を考慮したためと変更プロトコルを提案します。
Abstract
Schrenkiella parvulaは多重イオン毒性ストレスを含む様々 な非生物的ストレスに適応する extremophyte です。ツールは、実行可能な変換システムの不足によって制限されているし、利用可能な高品質のゲノム リソースにもかかわらず植物が環境に適応する方法を研究する強調、機能ゲノム学モデルとしての価値。このプロトコルで報告する安定した遺伝子組換え米 parvulaの生成方法アグロバクテリウム仲介された花のすくいメソッドを使用して行。不確定な開花習性と葉高エピクチクラ ワックス コンテンツなどs. parvulaのユニークな特徴を考慮してaに使用される変換プロトコルを変更しました。簡単に言えば、 S. parvula種子は植える前に 5 日間の 4 ° C で階層化しました。14 h 光と暗い 10 h と、130 µmol m-2の-1光強度、24 ° C に 22 の ° c の日長で栽培しました。8 複数花序と 9 週齢の工場には、変換に選ばれました。PMP90RKプラスミドを運ぶアグロバクテリウムGV3101 の浸透ソリューションは、これらの花序を浸したされました。花漬変換効率を高めるため 3 〜 4 週間の間隔で 2 回のラウンドを行った。T1 種子は、収集され、候補者の画面に発芽の行の変換前に、乾燥剤が付いている容器で 4 週間の乾燥します。バスタへの抵抗は、T1 植物を画面に使用されました。誤検知を減らすために 2 週古い工場で 3 日間の間隔で 3 回バスタ ソリューションを散布しました。バスタ ドロップ テストは真の肯定的な形質転換体を識別するために個々 の植物の存続で実行されました。変換効率 0.033 お %、10,000 T1 種子伝播あたり 3-4 遺伝子組換え植物の降伏であった。
Introduction
このプロトコルでは、成長と extremophyte モデルSchrenkiella parvulaの安定形質転換路線の設立について説明します。効率的な変換システムの可用性は、汎用性の高い遺伝的モデルの特徴です。極端な環境で繁栄する植物は、extremophytes、として環境ストレスに対する植物の適応を理解するための重要なリソースを提供するために呼ばれます。Schrenkiella parvula(旧Thellungiella parvulaと別 parvulum) ゲノム リソース1,2,3,4、5の拡大と、1 つのようなの extremophyte モデルです。ただし、変形のプロトコルまだ報告されていないs. parvulaの出版された調査で。
S. parvulaのゲノム アブラナ科 (マスタード キャベツ家族) で初公開された extremophyte ゲノムであり、非 extremophyte モデル、シロイヌナズナ1広範な全体的なゲノム シンテニーを示します。したがって、シロイヌナズナとs. parvula比較研究の恩恵S. parvulaゲノムがどのように進化し、規制に関する有益な仮説をするシロイヌナズナで行われた遺伝研究の富別様に対処する極端な環境は5,6,7を強調します。S. parvulaは最も耐塩性種の (土食塩 LD50 に基づいて) 知られている野生の親類間でa8の 1 つです。耐塩に加えて米 parvula存続させ、高濃度でほとんどの植物7に有毒である複数の塩イオン存在下におけるライフ サイクルを完了します。その自然の生息地で流行している非生物的ストレスに対する、それが展開する様々 な特性、その中でいくつかの生化学的、または生理学的なレベルの8,9,10、研究されています。 11。
2010 年、 S. parvula対象種としてまたは他の植物のゲノムとの比較でそれを使用する 400 以上のピア分列出版物がずっとあります。ただし、どのような研究が行われているのよく見るとクリアのボトルネックを識別できます。これらのレポートの大半は将来の研究で米 parvulaの潜在的な使用について話し合うまたは比較ゲノムまたはゲノミクス研究で使用します。概念実証の変形のプロトコルの不足のために確立S. parvula日付に利用可能な最高品質の植物ゲノムの 1 つを持っていることにもかかわらず、機能のゲノム研究で使用されていない (> 5 Mb contig N50) 組み立て、pseudomolecules 染色体レベル1に付きます。
アグロバクテリウム花ディップ法atrasngenic 行を作成する最も広く使用されている方法となっているし、変換の再現システムの開発だったとして、その成功の重要な要因、遺伝モデル12,13。ただし、すべてのアブラナ科の種は、シロイヌナズナの花のすくいの手法を使用して正常に変換する示されています。特別に、 S. parvulaを含むアブラナ科のリネージュ II 種は花のすくいに基づいて変換方法14,15に反抗的なされています。
S. parvula、その狭い葉の形態と組み合わせての不確定な開花生育は標準花ディップ アグロバクテリウム法を採用するために挑戦しました。本研究では、 S. parvulaの再現性のある変換を行った修正されたプロトコルを報告します。
Protocol
Representative Results
Discussion
植物の生理学的状態は、変換25の効率を大きく影響します。変換のための健康で、積極的な植物の使用は、 S. parvulaの正常な変形のための重要な要件です。水または重点を置かれた植物の光変換 (図 1、センター パネル) の理想的な健康な植物と比較して少ない花を持ちます。光強度で育てることができるS. parvula未満 130 µmol m-2の<su…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
この作品は、全米科学財団賞 MCB 1616827 によって支えられました。
Materials
| Agar | VWR International, Radnor, PA | 90000-762 | Bacto Agar Soldifying Agent, BD Diagnostics |
| B5 vitamins | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO | G1019 | Gamborg’s Vitamin Solution |
| Desiccant | W A Hammond Drierite, Xenia, OH | 22005 | Indicating DRIERITE 6 mesh |
| Destination vector for plant transformation | TAIR | Vector:6531113857 | pKGWFS7 |
| Electroporation cuvette | USA Scientific | 9104-5050 | Electroporation cuvette, round cap, 0.2 cm gap |
| Electroporator | BIO-RAD Laboratories, Hercules, CA | 1652100 | MicroPulser Electroporator |
| Fertilizer beads | Osmocote Garden, Marysville, OH | N/A | Osmocote Smart-Release Plant Food Flower & Vegetable |
| Gel extraction kit | iNtRON Biotechnology, Boston, MA | 17289 | MEGAquick-spin Total fragment DNA purification kit |
| Gentamicin | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO | G1914-5G | Gentamicin sulfate |
| Glufosinate-ammonium (11.3%) herbicide (BASTA) | Bayer environmental science, Montvale, NJ | N/A | FINALE herbicide |
| Kanamycin | VWR International, Radnor, PA | 200004-444 | Kanamycin monosulfate |
| MES | Bioworld, Dublin, OH | 41320024-2 | MES, Free Acid |
| MS salt | MP Biomedicals, Santa Anna, CA | 092621822 | Hoagland's modified basal salt mixture |
| N6-benzylaminopurine (BA) | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO | B3274 | 6-Benzylaminopurine solution |
| NaCl | Sigma-Alrich | S7653 | Sodium chloride |
| Non-ionic detergent | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO | 9005-64-5 | TWEEN 20 |
| Plasmid isolation kit | Zymo Research, Irvine, CA | D4036 | Zyppy Plasmid Kits |
| Recombinase enzyme mix kit | Life Technology | 11791-020 | Gateway LR Clonase II Enzyme mix |
| Rifampicin | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO | R3501-1G | Rifampicin, powder, >= 97% (HPLC) |
| Shaking incubator | ThermoFisher Scientific, Waltham, MA | SHKE4450 | MaxQ 4450 Benchtop Orbital Shakers |
| Soil mix | Sun Gro | SUN239223328CFLP | Sun Gro Metro-Mix 360 Grower Mix |
| Spectinomycin | VWR International, Radnor, PA | IC15206705 | |
| Sterile 50ml conical tubes | USA Scientific, Ocala, FL | 1500-1811 | 50 ml conical screw cap tubes, copolymer, racks, sterile |
| Sucrose | VWR International, Radnor, PA | 57-50-1 | Sucrose, ACS |
| Surfactant solution | Lehle seeds, Round Rock, TX | VIS-02 | Silwet L-77 |
| Topoisomerase-based cloning kit | Life Technologies, Carlsbad, CA | K240020 | pENTR/D-TOPO Cloning Kit, with One Shot TOP10 Chemically Competent E. coli |
| Tryptone | VWR International, Radnor, PA | 90000-282 | BD Bacto Tryptone, BD Biosciences |
| Yeast Extract | VWR International, Radnor, PA | 90000-722 | BD Bacto Yeast Extract, BD Biosciences |
References
- Dassanayake, M., et al. The genome of the extremophile crucifer Thellungiella parvula. Nature Genetics. 43 (9), 913-918 (2011).
- Oh, D. -. H., Dassanayake, M., Bohnert, H. J., Cheeseman, J. M. Life at the extreme: lessons from the genome. Genome Biology. 13 (3), 241 (2012).
- Whited, J. The Next Top Models. Cell. 163 (1), 18-20 (2015).
- Dassanayake, M., Yun, D. O. D., Bressan, R. A., Cheeseman, J. M., Bohnert, J. H. The scope of things to come: New paradigms in biotechnology. Plant Biotechnology and Agriculture: Prospects for the 21st Century. , 19-34 (2009).
- Dittami, S. M., Tonon, T. Genomes of extremophile crucifers: New platforms for comparative genomics and beyond. Genome Biology. 13 (8), 166 (2012).
- Amtmann, A. Learning from evolution: Thellungiella generates new knowledge on essential and critical components of abiotic stress tolerance in plants. Molecular Plant. 2 (1), 3-12 (2009).
- Oh, D. -. H., Hong, H., Lee, S. Y., Yun, D. -. J., Bohnert, H. J., Dassanayake, M. Genome structures and transcriptomes signify niche adaptation for the multiple-ion-tolerant extremophyte Schrenkiella parvula. Plant Physiology. 164 (4), 2123-2138 (2014).
- Orsini, F., et al. A comparative study of salt tolerance parameters in 11 wild relatives of Arabidopsis thaliana. Journal of Experimental Botany. 61 (13), 3787-3798 (2010).
- Uzilday, B., Ozgur, R., Sekmen, A. H., Yildiztugay, E., Turkan, I. Changes in the alternative electron sinks and antioxidant defence in chloroplasts of the extreme halophyte Eutrema parvulum (Thellungiella parvula) under salinity. Annals of Botany. 115 (3), 449-463 (2015).
- Teusink, R. S., Rahman, M., Bressan, R. A., Jenks, M. A. Cuticular waxes on Arabidopsis thaliana close relatives Thellungiella halophila and Thellungiella parvula. International Journal of Plant Sciences. 163 (2), 309-315 (2002).
- Jarvis, D. E., Ryu, C. H., Beilstein, M. A., Schumaker, K. S. Distinct roles for SOS1 in the convergent evolution of salt tolerance in Eutrema salsugineum and Schrenkiella parvula. Molecular Biology and Evolution. 31 (8), 2094-2107 (2014).
- Clough, S. J., Bent, A. F. Floral dip: A simplified method for Agrobacterium-mediated transformation of Arabidopsis thaliana. Plant Journal. 16 (6), 735-743 (1998).
- Koornneef, M., Meinke, D. The development of Arabidopsis as a model plant. Plant Journal. 61 (6), 909-921 (2010).
- Bai, J., Wu, F., Mao, Y., He, Y. In planta transformation of Brassica rapa and B. napus via vernalization-infiltration methods. Protocol Exchange. 10, 1028 (2013).
- Sparrow, P. A. C., Goldsack, C. M. P., Østergaard, L. Transformation technology in the Brassicaceae. Genetics and Genomics of the Brassicaceae. , 505-525 (2011).
- Hoagland, D. R., Arnon, D. I. The water-culture method for growing plants without soil. California Agricultural Experiment Station Circular. 347 (347), 1-32 (1950).
- Saiki, R., et al. Primer-directed enzymatic amplification of DNA with a thermostable DNA polymerase. Science. 239 (4839), 487-491 (1988).
- Sun, Y., Sriramajayam, K., Luo, D., Liao, D. J. A Quick, cost-free method of purification of dna fragments from agarose gel. Journal of Cancer. 3, 93-95 (2012).
- Sanger, F., Nicklen, S., Coulson, A. R. DNA sequencing with chain-terminating inhibitors. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 74 (12), 5463-5467 (1977).
- Bertani, G. Studies on Lysogenesis I. The mode of phage liberation by lysogenic Eschericia coli. Journal of Bacteriolgy. 62 (3), 293-300 (1951).
- Koncz, C., Martini, N., Szabados, L., Hrouda, M., Bachmair, A., Schell, J. Specialized vectors for gene tagging and expression studies. Plant Molecular Biology Manual. , 53-74 (1994).
- Weigel, D., Glazebrook, J. Transformation of Agrobacterium using electroporation. Cold Spring Harbor Protocols. 2006 (30), (2006).
- Murray, M. G., Thompson, W. F. Rapid isolation of high molecular weight plant DNA. Nucleic Acids Research. 8 (19), 4321-4326 (1980).
- Inan, G. Salt cress. a halophyte and cryophyte Arabidopsis relative model system and its applicability to molecular genetic analyses of growth and development of extremophiles. Plant Physiol. 135 (3), 1718-1737 (2004).
- Ghedira, R., De Buck, S., Nolf, J., Depicker, A. The efficiency of Arabidopsis thaliana floral dip transformation is determined not only by the Agrobacterium strain used but also by the physiology and the ecotype of the dipped plant. Molecular Plant-Microbe Interactions. 26 (7), 823-832 (2013).
- Shaohong, F. U., Xianya, W. E. I., Yingze, N. I. U., Shixing, G. U. O. Transformation of Brassica napus with the method of floral-dip. Biotechnology: Genomics and Its Applications. , 45-49 (2005).
- Li, J., Tan, X., Zhu, F., Guo, J. A rapid and simple method for Brassica napus floral-dip transformation and selection of transgenic plantlets. International Journal of Biology. 2 (1), 127 (2010).
- Li, H. Q., Xu, J., Chen, L., Li, M. R. Establishment of an efficient Agrobacterium tumefaciens-mediated leaf disc transformation of Thellungiella halophila. Plant Cell Reports. 26 (10), 1785-1789 (2007).
- Wu, G., Rossidivito, G., Hu, T., Berlyand, Y., Poethig, R. S. Traffic lines: New tools for genetic analysis in Arabidopsis thaliana. Genetics. 200 (1), 35-45 (2015).
