Agrobacterium-gemedieerde transformatie met een bloemen-dip-methode kan met succes worden gebruikt om het creëren van stabiele transgene lijnen van het extremophyte model Schrenkiella parvula. We presenteren een protocol aangepast ten opzichte van die voor Arabidopsis thaliana, overwegen verschillende groei gewoonten en fysiologische kenmerken van de extremophyte.
Schrenkiella parvula is een extremophyte aangepast aan verschillende abiotische stress, met inbegrip van meervoudige ion toxiciteit druk. Ondanks hoge kwaliteit genomic middelen beschikbaar om te bestuderen hoe de planten zich aanpassen aan milieu benadrukt, zijn waarde als een model van de functionele genomica en gereedschap heeft is beperkt door het ontbreken van een haalbaar transformatie-systeem. In dit protocol rapporteren we hoe te genereren van stabiele transgene S. parvula lijnen met behulp van een methode met Agrobacterium-gemedieerde floral-dip. We bewerkt de transformatie-protocol dat wordt gebruikt voor A. thaliana ter verantwoording voor de unieke eigenschappen van S. parvula, zoals de gewoonte van een onbepaalde bloei en een gehalte aan hoge epicuticular was op Bladeren. S. parvula zaden waren kort, gelaagde bij 4 ° C voor vijf dagen voor het planten. Planten zijn geteeld op een fotoperiode van een 14 h licht en 10 uur donker en een 130 µmol m-2s-1 lichtintensiteit, bij 22 ° C tot 24 ° C. Acht tot negen weken oude planten met meerdere bloeiwijzen werden geselecteerd voor transformatie. Deze bloeiwijzen werden ondergedompeld in een oplossing van de infiltratie van Agrobacterium tumefaciens GV3101 uitvoering van de pMP90RK -plasmide. Wij uitgevoerd twee rondes van de bloem dompelen met een interval van drie tot vier weken de transformatie-efficiëntie te verhogen. De T1 zaden werden verzameld en gedroogd voor vier weken in een container met droogmiddelen alvorens kiemkracht aan het scherm voor kandidaat getransformeerd lijnen. Weerstand tegen BASTA werd gebruikt om het scherm T1 planten. Wij de oplossing BASTA gespoten driemaal met een tussenpauze van drie dagen vanaf twee weken oude planten om valse positieven. Een valproef BASTA werd uitgevoerd op het overleven van de individuele planten te identificeren waar positieve transformants. De efficiëntie van de transformatie was 0.033%, opbrengst 3 – 4 transgene planten per 10.000 T1 zaden gekweekt.
In dit protocol beschrijven we de groei en de totstandbrenging van stabiele transgene lijnen voor het extremophyte model Schrenkiella parvula. De beschikbaarheid van een efficiënte transformatie-systeem is een kenmerk van een veelzijdige genetische model. Planten die bloeien in extreme omgevingen, waarnaar wordt verwezen als extremophytes, bieden een essentiële hulpbron voor het begrijpen van de plant aanpassingen aan milieu benadrukt. Schrenkiella parvula (voorheen Thellungiella parvula en Eutrema parvulum) is een model van dergelijke extremophyte, met het uitbreiden van genomic middelen1,2,3,4,5. Echter, transformatie protocollen hebben nog niet is gerapporteerd voor S. parvula in gepubliceerde studies.
Het genoom van S. parvula is de eerste gepubliceerde extremophyte genoom in kruisbloemenfamilie (mosterd-kool familie) en toont een uitgebreide totale genoom synteny met het niet-extremophyte model, Arabidopsis thaliana1. Dus, vergelijkende studies tussen A. thaliana en S. parvula kon profiteren van de rijkdom aan genetische studies uitgevoerd op A. thaliana om informatieve hypothesen over hoe het genoom S. parvula heeft zich ontwikkeld en geregeld anders om te gaan met benadrukt extreme milieu5,6,7. S. parvula is een van de meest zout-tolerante soorten (gebaseerd op bodem NaCl LD50) onder bekende wilde verwanten A. thaliana8. Naast de NaCl-tolerantie, S. parvula overleeft en voltooit de levenscyclus in de aanwezigheid van meerdere zout ionen bij hoge concentraties giftig voor de meeste planten7. In reactie op de abiotische stress overwegend in zijn natuurlijke habitat, het heeft zich ontwikkeld van verschillende eigenschappen, waaronder zijn verschillende bestudeerd op de biochemische of fysiologisch niveau 8,,9,10, 11.
Sinds 2010 zijn er meer dan 400 publicaties van peer-reveiwed die S. parvula gebruikt als doelsoort of gebruikt in een vergelijking met andere plant genomen. Echter kan een duidelijk knelpunt worden geïdentificeerd met een kijkje van wat voor soort studies zijn uitgevoerd. De meerderheid van deze verslagen bespreken het potentiële gebruik van S. parvula in toekomstige studies of het gebruik in vergelijkende genomic of phylogenomic studies. Als gevolg van het ontbreken van een proof-of-concept transformatie protocol vastgesteld voor S. parvula, het is niet gebruikt in functionele genomische studie, ondanks het feit dat een van de hoogste kwaliteit plant genomen beschikbaar tot op heden (> 5 Mb aanliggend N50) gemonteerd en geannoteerde in pseudomolecules van chromosoom-niveau1.
De Agrobacterium-gemedieerde floral-dip transformatie methode is de meest algemeen gebruikte methode lijnen te maken trasngenic in A. thalianageworden, en de ontwikkeling van een reproduceerbare systeem van transformatie was een kritieke factor in het succes als een genetische model12,13. Niet alle soorten van de Brassicaceae hebben echter aangetoond dat het met succes worden omgezet met behulp van de methode van de bloemen-dip ontwikkeld voor A. thaliana. Speciaal, de Brassicaceae Lineage II-soorten die S. parvula omvatten geweest recalcitrante floral-dip op basis transformatie methoden14,15.
De onbepaalde bloeiende groei gewoonte van S. parvula, gecombineerd met haar smalle blad morfologie heeft gemaakt het uitdagend om de standaard Agrobacterium-gemedieerde floral-dip transformatie methode te hanteren. In deze studie rapporteren we het gewijzigde protocol die wij hebben ontwikkeld voor reproduceerbare transformatie van S. parvula.
De fysiologische toestand van de plant aanzienlijk invloed op de efficiëntie van transformatie25. Het gebruik van gezonde en krachtige planten voor transformatie is een basisvereiste voor een succesvolle hervorming van S. parvula. Water of lichte gestresst planten zullen hebben minder bloemen in vergelijking met de gezonde planten ideaal voor transformatie (Figuur 1, midden paneel). S. parvula kunnen groeien met een lage intensiteit minder dan 130 ?…
The authors have nothing to disclose.
Dit werk werd gesteund door een award van de National Science Foundation MCB 1616827.
Agar | VWR International, Radnor, PA | 90000-762 | Bacto Agar Soldifying Agent, BD Diagnostics |
B5 vitamins | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO | G1019 | Gamborg’s Vitamin Solution |
Desiccant | W A Hammond Drierite, Xenia, OH | 22005 | Indicating DRIERITE 6 mesh |
Destination vector for plant transformation | TAIR | Vector:6531113857 | pKGWFS7 |
Electroporation cuvette | USA Scientific | 9104-5050 | Electroporation cuvette, round cap, 0.2 cm gap |
Electroporator | BIO-RAD Laboratories, Hercules, CA | 1652100 | MicroPulser Electroporator |
Fertilizer beads | Osmocote Garden, Marysville, OH | N/A | Osmocote Smart-Release Plant Food Flower & Vegetable |
Gel extraction kit | iNtRON Biotechnology, Boston, MA | 17289 | MEGAquick-spin Total fragment DNA purification kit |
Gentamicin | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO | G1914-5G | Gentamicin sulfate |
Glufosinate-ammonium (11.3%) herbicide (BASTA) | Bayer environmental science, Montvale, NJ | N/A | FINALE herbicide |
Kanamycin | VWR International, Radnor, PA | 200004-444 | Kanamycin monosulfate |
MES | Bioworld, Dublin, OH | 41320024-2 | MES, Free Acid |
MS salt | MP Biomedicals, Santa Anna, CA | 092621822 | Hoagland's modified basal salt mixture |
N6-benzylaminopurine (BA) | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO | B3274 | 6-Benzylaminopurine solution |
NaCl | Sigma-Alrich | S7653 | Sodium chloride |
Non-ionic detergent | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO | 9005-64-5 | TWEEN 20 |
Plasmid isolation kit | Zymo Research, Irvine, CA | D4036 | Zyppy Plasmid Kits |
Recombinase enzyme mix kit | Life Technology | 11791-020 | Gateway LR Clonase II Enzyme mix |
Rifampicin | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO | R3501-1G | Rifampicin, powder, >= 97% (HPLC) |
Shaking incubator | ThermoFisher Scientific, Waltham, MA | SHKE4450 | MaxQ 4450 Benchtop Orbital Shakers |
Soil mix | Sun Gro | SUN239223328CFLP | Sun Gro Metro-Mix 360 Grower Mix |
Spectinomycin | VWR International, Radnor, PA | IC15206705 | |
Sterile 50ml conical tubes | USA Scientific, Ocala, FL | 1500-1811 | 50 ml conical screw cap tubes, copolymer, racks, sterile |
Sucrose | VWR International, Radnor, PA | 57-50-1 | Sucrose, ACS |
Surfactant solution | Lehle seeds, Round Rock, TX | VIS-02 | Silwet L-77 |
Topoisomerase-based cloning kit | Life Technologies, Carlsbad, CA | K240020 | pENTR/D-TOPO Cloning Kit, with One Shot TOP10 Chemically Competent E. coli |
Tryptone | VWR International, Radnor, PA | 90000-282 | BD Bacto Tryptone, BD Biosciences |
Yeast Extract | VWR International, Radnor, PA | 90000-722 | BD Bacto Yeast Extract, BD Biosciences |