Pianta di crescita e trasformazione di Floral-dip mediata da Agrobacterium della Extremophyte Schrenkiella parvula
Summary
Trasformazione mediata da Agrobacterium utilizzando un metodo floreale-dip può essere impiegato con successo per creare linee transgeniche stabile del modello extremophyte Schrenkiella parvula. Vi presentiamo un protocollo modificato da quello per Arabidopsis thaliana, considerando le abitudini differenti di sviluppo e caratteristiche fisiologiche della extremophyte.
Abstract
Schrenkiella parvula è un extremophyte adattato a diversi stress abiotici, tra cui molteplici sollecitazioni di tossicità dello ione. Nonostante alta qualità risorse genomiche disponibili per studiare come adattano le piante per ambientale sottolinea, suo valore come un modello di genomica funzionale e strumento è stata limitata dalla mancanza di un sistema di trasformazione fattibile. In questo protocollo, segnaliamo come generare transgenici stabile S. parvula linee utilizzando un metodo di floreale-dip mediata da Agrobacterium. Abbiamo modificato il protocollo di trasformazione usato per a. thaliana per rappresentare caratteristiche uniche di S. parvula, come un’abitudine di fioritura indeterminato e un contenuto di cere epicuticolari alta sulle foglie. In breve, S. parvula semi sono stati stratificati a 4 ° C per cinque giorni prima della piantatura. Piante sono state coltivate in un fotoperiodo di una luce 14h e 10 h scuro e un 130 µmol m-2s-1 intensità della luce, a 22 ° C a 24 ° C. Otto a nove settimane piante con infiorescenze multiple sono stati selezionati per la trasformazione. Queste infiorescenze sono stati immersi in una soluzione di infiltrazione di Agrobacterium tumefaciens GV3101 portando il plasmide pMP90RK . Abbiamo effettuato due giri del fiore di immersione con un intervallo di tre o quattro settimane per aumentare l’efficienza di trasformazione. I semi T1 sono stati raccolti e asciugati per quattro settimane in un contenitore con materiale essicante prima germinazione alla schermata per candidato trasformato le linee. Resistenza a BASTA era usata per selezionare piante T1. Abbiamo spruzzato la soluzione BASTA tre volte con un intervallo di tre giorni a partire da due settimana-vecchi impianti per ridurre i falsi positivi. È stata eseguita una prova di caduta BASTA sopravvivere singole piante per identificare il vero positivo trasformanti. L’efficienza di trasformazione era 0,033%, producendo piante transgeniche di 3 – 4 per 10.000 semi T1 propagate.
Introduction
In questo protocollo, descriviamo la crescita e la creazione di linee transgeniche stabili per il modello extremophyte Schrenkiella parvula. La disponibilità di un sistema efficiente trasformazione è un marchio di garanzia di qualsiasi modello genetico versatile. Piante che prosperano in ambienti estremi, di cui come extremophytes, fornire una risorsa fondamentale per comprendere gli adattamenti della pianta agli stress ambientali. Schrenkiella parvula (precedentemente Thellungiella parvula ed Eutrema parvulum) è uno di questi modelli extremophyte, con espansione risorse genomiche1,2,3,4,5. Tuttavia, protocolli di trasformazione non sono ancora stati segnalati per S. parvula negli studi pubblicati.
Il genoma di S. parvula è il primo genoma di extremophyte pubblicato in Brassicaceae (famiglia senape-cavolo) e Mostra un’ampia sintenia genoma globale con il modello di non-extremophyte, Arabidopsis thaliana1. Così, gli studi comparativi tra a. thaliana e S. parvula potrebbero beneficiare della ricchezza di studi genetici su a. thaliana formulare delle ipotesi ben informativi su come si è evoluto e regolato il genoma di s. parvula in modo diverso per affrontare estremi ambientali sottolinea5,6,7. S. parvula è una delle specie più sale-tolleranti (basati su terreno NaCl LD50) tra parenti selvatici noti di a. thaliana8. Oltre la tolleranza di NaCl, S. parvula sopravvive e completa il suo ciclo di vita in presenza di ioni più sale alle alte concentrazioni tossiche per la maggior parte delle piante7. In risposta agli stress abiotici prevalente nel suo habitat naturale, si sono evoluto varie caratteristiche, tra cui molti sono stati studiati i biochimici o fisiologico livello 8,9,10, 11.
Dal 2010, ci sono state oltre 400 pubblicazioni peer-reveiwed utilizzato S. parvula come specie bersaglio o in un confronto con altri genomi delle piante. Tuttavia, un collo di bottiglia chiaro potrebbe essere identificato con uno sguardo più attento di che tipo di studi sono stati condotti. La maggior parte di questi rapporti discuterà l’uso potenziale di S. parvula negli studi futuri o utilizzarlo in genomica comparativa o phylogenomic studi. A causa della mancanza di un protocollo di proof-of-concept trasformazione stabilito per S. parvula, non è stato utilizzato in studi di genomica funzionale, pur avendo uno dei genomi di pianta più alti di qualità ad oggi disponibili (> 5 Mb contig N50) assemblato e annotato in pseudomolecules livello del cromosoma1.
Il metodo di trasformazione mediata da Agrobacterium di floreale-dip è diventato il metodo più ampiamente usato per creare linee di trasngenic in a. thaliana, e lo sviluppo di un sistema riproducibile di trasformazione era un fattore critico di successo come un modello genetico12,13. Tuttavia, non tutte le specie di Brassicaceae hanno dimostrate di essere trasformata con successo utilizzando il metodo floreale-dip sviluppato per a. thaliana. Appositamente, la specie di Brassicaceae Lineage II che includono S. parvula è stato ricalcitrante a trasformazione base floreale-dip metodi14,15.
L’abitudine di crescita indeterminato fioritura di S. parvula, combinato con la sua morfologia foglia stretta ha reso impegnativo di adottare il metodo standard mediata da Agrobacterium floreale-tuffo trasformazione. In questo studio, segnaliamo il protocollo modificato che abbiamo sviluppato per riproducibile trasformazione di S. parvula.
Protocol
Representative Results
Discussion
Lo stato fisiologico della pianta influenza significativamente l’efficienza di trasformazione25. L’utilizzo di piante sane e vigorose per trasformazione è un requisito chiave per la trasformazione di successo in S. parvula. Acqua o luce piante stressati avrà meno fiori rispetto alle piante sane ideale per la trasformazione (Figura 1, pannello centrale). S. parvula può crescere con un’intensità di luce inferiore a 130 µmol m-2 s-1…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Questo lavoro è stato supportato da un premio della National Science Foundation 1616827 MCB.
Materials
| Agar | VWR International, Radnor, PA | 90000-762 | Bacto Agar Soldifying Agent, BD Diagnostics |
| B5 vitamins | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO | G1019 | Gamborg’s Vitamin Solution |
| Desiccant | W A Hammond Drierite, Xenia, OH | 22005 | Indicating DRIERITE 6 mesh |
| Destination vector for plant transformation | TAIR | Vector:6531113857 | pKGWFS7 |
| Electroporation cuvette | USA Scientific | 9104-5050 | Electroporation cuvette, round cap, 0.2 cm gap |
| Electroporator | BIO-RAD Laboratories, Hercules, CA | 1652100 | MicroPulser Electroporator |
| Fertilizer beads | Osmocote Garden, Marysville, OH | N/A | Osmocote Smart-Release Plant Food Flower & Vegetable |
| Gel extraction kit | iNtRON Biotechnology, Boston, MA | 17289 | MEGAquick-spin Total fragment DNA purification kit |
| Gentamicin | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO | G1914-5G | Gentamicin sulfate |
| Glufosinate-ammonium (11.3%) herbicide (BASTA) | Bayer environmental science, Montvale, NJ | N/A | FINALE herbicide |
| Kanamycin | VWR International, Radnor, PA | 200004-444 | Kanamycin monosulfate |
| MES | Bioworld, Dublin, OH | 41320024-2 | MES, Free Acid |
| MS salt | MP Biomedicals, Santa Anna, CA | 092621822 | Hoagland's modified basal salt mixture |
| N6-benzylaminopurine (BA) | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO | B3274 | 6-Benzylaminopurine solution |
| NaCl | Sigma-Alrich | S7653 | Sodium chloride |
| Non-ionic detergent | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO | 9005-64-5 | TWEEN 20 |
| Plasmid isolation kit | Zymo Research, Irvine, CA | D4036 | Zyppy Plasmid Kits |
| Recombinase enzyme mix kit | Life Technology | 11791-020 | Gateway LR Clonase II Enzyme mix |
| Rifampicin | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO | R3501-1G | Rifampicin, powder, >= 97% (HPLC) |
| Shaking incubator | ThermoFisher Scientific, Waltham, MA | SHKE4450 | MaxQ 4450 Benchtop Orbital Shakers |
| Soil mix | Sun Gro | SUN239223328CFLP | Sun Gro Metro-Mix 360 Grower Mix |
| Spectinomycin | VWR International, Radnor, PA | IC15206705 | |
| Sterile 50ml conical tubes | USA Scientific, Ocala, FL | 1500-1811 | 50 ml conical screw cap tubes, copolymer, racks, sterile |
| Sucrose | VWR International, Radnor, PA | 57-50-1 | Sucrose, ACS |
| Surfactant solution | Lehle seeds, Round Rock, TX | VIS-02 | Silwet L-77 |
| Topoisomerase-based cloning kit | Life Technologies, Carlsbad, CA | K240020 | pENTR/D-TOPO Cloning Kit, with One Shot TOP10 Chemically Competent E. coli |
| Tryptone | VWR International, Radnor, PA | 90000-282 | BD Bacto Tryptone, BD Biosciences |
| Yeast Extract | VWR International, Radnor, PA | 90000-722 | BD Bacto Yeast Extract, BD Biosciences |
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