Summary

Pianta di crescita e trasformazione di Floral-dip mediata da Agrobacterium della Extremophyte Schrenkiella parvula

Published: January 07, 2019
doi:

Summary

Trasformazione mediata da Agrobacterium utilizzando un metodo floreale-dip può essere impiegato con successo per creare linee transgeniche stabile del modello extremophyte Schrenkiella parvula. Vi presentiamo un protocollo modificato da quello per Arabidopsis thaliana, considerando le abitudini differenti di sviluppo e caratteristiche fisiologiche della extremophyte.

Abstract

Schrenkiella parvula è un extremophyte adattato a diversi stress abiotici, tra cui molteplici sollecitazioni di tossicità dello ione. Nonostante alta qualità risorse genomiche disponibili per studiare come adattano le piante per ambientale sottolinea, suo valore come un modello di genomica funzionale e strumento è stata limitata dalla mancanza di un sistema di trasformazione fattibile. In questo protocollo, segnaliamo come generare transgenici stabile S. parvula linee utilizzando un metodo di floreale-dip mediata da Agrobacterium. Abbiamo modificato il protocollo di trasformazione usato per a. thaliana per rappresentare caratteristiche uniche di S. parvula, come un’abitudine di fioritura indeterminato e un contenuto di cere epicuticolari alta sulle foglie. In breve, S. parvula semi sono stati stratificati a 4 ° C per cinque giorni prima della piantatura. Piante sono state coltivate in un fotoperiodo di una luce 14h e 10 h scuro e un 130 µmol m-2s-1 intensità della luce, a 22 ° C a 24 ° C. Otto a nove settimane piante con infiorescenze multiple sono stati selezionati per la trasformazione. Queste infiorescenze sono stati immersi in una soluzione di infiltrazione di Agrobacterium tumefaciens GV3101 portando il plasmide pMP90RK . Abbiamo effettuato due giri del fiore di immersione con un intervallo di tre o quattro settimane per aumentare l’efficienza di trasformazione. I semi T1 sono stati raccolti e asciugati per quattro settimane in un contenitore con materiale essicante prima germinazione alla schermata per candidato trasformato le linee. Resistenza a BASTA era usata per selezionare piante T1. Abbiamo spruzzato la soluzione BASTA tre volte con un intervallo di tre giorni a partire da due settimana-vecchi impianti per ridurre i falsi positivi. È stata eseguita una prova di caduta BASTA sopravvivere singole piante per identificare il vero positivo trasformanti. L’efficienza di trasformazione era 0,033%, producendo piante transgeniche di 3 – 4 per 10.000 semi T1 propagate.

Introduction

In questo protocollo, descriviamo la crescita e la creazione di linee transgeniche stabili per il modello extremophyte Schrenkiella parvula. La disponibilità di un sistema efficiente trasformazione è un marchio di garanzia di qualsiasi modello genetico versatile. Piante che prosperano in ambienti estremi, di cui come extremophytes, fornire una risorsa fondamentale per comprendere gli adattamenti della pianta agli stress ambientali. Schrenkiella parvula (precedentemente Thellungiella parvula ed Eutrema parvulum) è uno di questi modelli extremophyte, con espansione risorse genomiche1,2,3,4,5. Tuttavia, protocolli di trasformazione non sono ancora stati segnalati per S. parvula negli studi pubblicati.

Il genoma di S. parvula è il primo genoma di extremophyte pubblicato in Brassicaceae (famiglia senape-cavolo) e Mostra un’ampia sintenia genoma globale con il modello di non-extremophyte, Arabidopsis thaliana1. Così, gli studi comparativi tra a. thaliana e S. parvula potrebbero beneficiare della ricchezza di studi genetici su a. thaliana formulare delle ipotesi ben informativi su come si è evoluto e regolato il genoma di s. parvula in modo diverso per affrontare estremi ambientali sottolinea5,6,7. S. parvula è una delle specie più sale-tolleranti (basati su terreno NaCl LD50) tra parenti selvatici noti di a. thaliana8. Oltre la tolleranza di NaCl, S. parvula sopravvive e completa il suo ciclo di vita in presenza di ioni più sale alle alte concentrazioni tossiche per la maggior parte delle piante7. In risposta agli stress abiotici prevalente nel suo habitat naturale, si sono evoluto varie caratteristiche, tra cui molti sono stati studiati i biochimici o fisiologico livello 8,9,10, 11.

Dal 2010, ci sono state oltre 400 pubblicazioni peer-reveiwed utilizzato S. parvula come specie bersaglio o in un confronto con altri genomi delle piante. Tuttavia, un collo di bottiglia chiaro potrebbe essere identificato con uno sguardo più attento di che tipo di studi sono stati condotti. La maggior parte di questi rapporti discuterà l’uso potenziale di S. parvula negli studi futuri o utilizzarlo in genomica comparativa o phylogenomic studi. A causa della mancanza di un protocollo di proof-of-concept trasformazione stabilito per S. parvula, non è stato utilizzato in studi di genomica funzionale, pur avendo uno dei genomi di pianta più alti di qualità ad oggi disponibili (> 5 Mb contig N50) assemblato e annotato in pseudomolecules livello del cromosoma1.

Il metodo di trasformazione mediata da Agrobacterium di floreale-dip è diventato il metodo più ampiamente usato per creare linee di trasngenic in a. thaliana, e lo sviluppo di un sistema riproducibile di trasformazione era un fattore critico di successo come un modello genetico12,13. Tuttavia, non tutte le specie di Brassicaceae hanno dimostrate di essere trasformata con successo utilizzando il metodo floreale-dip sviluppato per a. thaliana. Appositamente, la specie di Brassicaceae Lineage II che includono S. parvula è stato ricalcitrante a trasformazione base floreale-dip metodi14,15.

L’abitudine di crescita indeterminato fioritura di S. parvula, combinato con la sua morfologia foglia stretta ha reso impegnativo di adottare il metodo standard mediata da Agrobacterium floreale-tuffo trasformazione. In questo studio, segnaliamo il protocollo modificato che abbiamo sviluppato per riproducibile trasformazione di S. parvula.

Protocol

1. pianta crescita Sterilizzazione di seme (opzionale) Preparare 50% candeggina in acqua bidistillata (ddH2O) con 1 o 2 gocce di un detergente non ionico (Vedi Tabella materiali) in una provetta da 50 mL. Capovolgere la provetta diverse volte per miscelare la soluzione.Nota: È preferibile effettuare la sterilizzazione di seme in un flusso laminare con una superficie di UV sterilizzata per 15 min. Aggiungere la soluzione di …

Representative Results

Abbiamo sviluppato un protocollo di trasformazione che consente la raccolta dei semi di T0 entro 150 giorni, utilizzando un metodo di floreale-dip modificato da quello di a. thaliana. La figura 1 Mostra un riepilogo della timeline e S. parvula piante che rappresentano la fase ottima per l’esecuzione della trasformazione attraverso floreale-dip. Abbiamo scelto S. parvula piante con fiori di 70 -80 in più infiorescenze a 6…

Discussion

Lo stato fisiologico della pianta influenza significativamente l’efficienza di trasformazione25. L’utilizzo di piante sane e vigorose per trasformazione è un requisito chiave per la trasformazione di successo in S. parvula. Acqua o luce piante stressati avrà meno fiori rispetto alle piante sane ideale per la trasformazione (Figura 1, pannello centrale). S. parvula può crescere con un’intensità di luce inferiore a 130 µmol m-2 s-1…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Questo lavoro è stato supportato da un premio della National Science Foundation 1616827 MCB.

Materials

Agar VWR International, Radnor, PA 90000-762 Bacto Agar Soldifying Agent, BD Diagnostics
B5 vitamins Sigma-Aldrich, St. Louis, MO G1019 Gamborg’s Vitamin Solution
Desiccant W A Hammond Drierite, Xenia, OH 22005 Indicating DRIERITE 6 mesh
Destination vector for plant transformation TAIR Vector:6531113857 pKGWFS7
Electroporation cuvette USA Scientific 9104-5050 Electroporation cuvette, round cap, 0.2 cm gap
Electroporator BIO-RAD Laboratories, Hercules, CA 1652100 MicroPulser Electroporator
Fertilizer beads Osmocote Garden, Marysville, OH N/A Osmocote Smart-Release Plant Food Flower & Vegetable
Gel extraction kit iNtRON Biotechnology, Boston, MA 17289 MEGAquick-spin Total fragment DNA purification kit
Gentamicin Sigma-Aldrich, St. Louis, MO G1914-5G Gentamicin sulfate
Glufosinate-ammonium (11.3%) herbicide (BASTA) Bayer environmental science, Montvale, NJ N/A FINALE herbicide
Kanamycin VWR International, Radnor, PA 200004-444 Kanamycin monosulfate
MES Bioworld, Dublin, OH 41320024-2 MES, Free Acid
MS salt MP Biomedicals, Santa Anna, CA 092621822 Hoagland's modified basal salt mixture
N6-benzylaminopurine (BA)  Sigma-Aldrich, St. Louis, MO B3274 6-Benzylaminopurine solution
NaCl Sigma-Alrich S7653 Sodium chloride
Non-ionic detergent Sigma-Aldrich, St. Louis, MO 9005-64-5 TWEEN 20 
Plasmid isolation kit Zymo Research, Irvine, CA D4036 Zyppy Plasmid Kits
Recombinase enzyme mix kit Life Technology 11791-020 Gateway LR Clonase II Enzyme mix
Rifampicin Sigma-Aldrich, St. Louis, MO R3501-1G Rifampicin, powder, >= 97% (HPLC)
Shaking incubator ThermoFisher Scientific, Waltham, MA SHKE4450 MaxQ 4450 Benchtop Orbital Shakers
Soil mix Sun Gro SUN239223328CFLP Sun Gro Metro-Mix 360 Grower Mix
Spectinomycin VWR International, Radnor, PA IC15206705
Sterile 50ml conical tubes USA Scientific, Ocala, FL 1500-1811 50 ml conical screw cap tubes, copolymer, racks, sterile
Sucrose VWR International, Radnor, PA 57-50-1 Sucrose, ACS
Surfactant solution Lehle seeds, Round Rock, TX VIS-02 Silwet L-77
Topoisomerase-based cloning kit Life Technologies, Carlsbad, CA K240020 pENTR/D-TOPO Cloning Kit, with One Shot TOP10 Chemically Competent E. coli
Tryptone VWR International, Radnor, PA 90000-282 BD Bacto Tryptone, BD Biosciences
Yeast Extract VWR International, Radnor, PA 90000-722  BD Bacto Yeast Extract, BD Biosciences

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Cite This Article
Wang, G., Pantha, P., Tran, K., Oh, D., Dassanayake, M. Plant Growth and Agrobacterium-mediated Floral-dip Transformation of the Extremophyte Schrenkiella parvula. J. Vis. Exp. (143), e58544, doi:10.3791/58544 (2019).

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