Inmunización de Alpacas (Lama pacos) con antígenos de la proteína y la producción de anticuerpos de dominio único antígeno específico

Todos los procedimientos con las alpacas fueron realizados según protocolos (2627 2017 y 2018-2925) aprobados por la Universidad de Kentucky institucional cuidado Animal y el Comité uso (IACUC). 1. generación de anticuerpos antígeno específicos Alpaca Manejo de la alpaca y consideraciones generales Obtener la aprobación institucional y regulador apropiado. Obtener alpacas adultas, menos de 10 años de edad con un cuerpo condición puntuación de por lo menos 3.0 (escala 1-5)12. Porque son animales de manada, de la casa un mínimo de dos, pero preferiblemente tres animales juntos.Nota: Los machos se recomiendan porque, en general, tienen un temperamento más y son más fáciles de trabajar con. Comprobar el estado de salud de los animales a través de un examen veterinario incluyendo la revisión de la dieta, vivienda, vacunación y control de parásito programas13. Asegúrese de que los animales estén al día con las vacunas correspondientes a la región geográfica local en base a recomendaciones de veterinarias profesionales. Desarrollar un programa de control de ecto y endoparásitos en consulta con un veterinario basado en una revisión de la historia de la manada de origen y las condiciones locales específicas13. Aclimatación de por lo menos una semana, incluyendo formación de halter y exposición al sistema de seguridad para. Recoger una muestra de 4 mL sangre para obtener suero para uso como control de inmunización previa (véase el paso 1.4). Los sueros de congelar y almacenar a-20 ° C en alícuotas de 0.5 mL.Nota: En este momento, se puede tomar sangre adicional para que el análisis de células de sangre completo (CBC) supervisar el estado de salud inicial de los animales. Preparación del antígeno Preparación de antígenos de la proteína purificada en tampón fosfato salino (PBS) o solución salina tamponada con HEPES (HBS) y concentrado a ≥1 mg/mL. Aproximadamente 3 mg de la proteína es necesaria para el protocolo completo, incluida la inmunización, la panorámica y la confirmación de clones.Nota: Anticuerpos de camélidos Mostrar la alta especificidad y selectividad contra antígenos de la proteína pero generalmente no son adecuados para proteínas o antígenos péptidos que son generalmente no estructurados. Establecer la pureza del antígeno, con pureza > 90% deseado. Utilizar un método analítico como SDS-PAGE.PRECAUCIÓN: Contaminación significativa con otras proteínas puede conducir a problemas durante la selección donde se puede aislados contaminantes en lugar de la proteína diana anticuerpos de dominio único. Preparar alícuotas congeladas de antígeno que contiene un total de 100 μg de antígeno. 50 μl de una preparación de 2 mg/mL es ideal. 100 μl de 1 mg/mL es la solución más diluida de proteína adecuada para la inmunización. Alternativamente, si el antígeno no se someten a congelación/descongelación y se sabe para ser estable a largo plazo de solución, se puede almacenar a 4 ° C.Nota: Para asegurar que el antígeno puede someterse a un ciclo de congelamiento/descongelamiento, prueba que una alícuota de 20 μl del antígeno se debe dispensar en un fino pared tubo PCR y el resorte congelado en nitrógeno líquido. Descongelar el tubo, realizar la centrifugación de alta velocidad y verificar la recuperación cuantitativa mediante la comparación de absorción UV/VIS antes y después de la congelación o mediante la ejecución de un gel de SDS-PAGE. Si es posible, el antígeno también debe ser evaluado para la retención de la actividad biológica. Si el ciclo de deshielo de congelamiento es exitoso, el antígeno restante es complemento congelado en alícuotas μl 100 y se almacenó a-80 ° C. Si hay problemas con el ciclo de congelamiento/descongelamiento, el protocolo puede repetirse con la adición de hasta un 20% glicerol. Inmunización Mezcla hasta cinco antígenos, 200 μg cada una, con adyuvante en un volumen final de entre 300 a 1.000 μl. El ayudante debe constituir ≥50% del volumen final con agua como diluyente.Nota: Si el búfer es necesario, utilice HEPES, fregonas o glicina. Un pH entre 5 y 6 ha demostrado a menudo para ser más favorable que estrictamente neutral. Evitar polivalentes iones como fosfato o citrato, ya que pueden provocar la coagulación. Recorte el pelo de la alpaca con cortauñas eléctricos, en forma de media luna a lo largo de la base de su cuello de hombro a hombro para exponer a las regiones adyacentes a los ganglios linfáticos de arco. Sostiene la alpaca por el cuello, inyecte lentamente el antígeno por vía subcutánea a lo largo de la base de la nuca cerca de los nodos de linfa de arco usando una aguja de 22 G. Realizar cinco inyecciones de ~ 200 μl (o menos) ~ 5 cm de separación.Nota: Los animales deben ser refrenados por un segundo miembro del personal durante las inyecciones. Inyección y sangrado alpacas requiere precaución ya que son propensos a patadas, no solo desde atrás pero hacia los lados. Tener los animales cerca uno del otro, en un grupo, durante el procedimiento es óptimo. Ya que son animales de manada, son más tranquilos en un grupo y menos vigorosa contención es necesaria durante los procedimientos. Monitorear los animales para ~ 20 min después de la inyección para detectar signos de anafilaxia (ver paso 1.6). Monitor de inflamación localizada en los sitios de inyección semanal, que no se espera al utilizar el coadyuvante recomendado. Asegúrese de que la fuga de sangre desde el sitio de inyección no sea excesiva. Realizar cinco inyecciones de refuerzo posterior semanal con 100 μg de cada antígeno en la mezcla. Recorte de pelo en los sitios de inyección pueden requerir semanalmente dependiendo de la temporada. En otoño e invierno, pelo de los animales puede crecer rápidamente. Sangre de dibujo Clip y desinfectar el sitio de colección con hisopos de alcohol. Sujetar al animal suavemente con el cuello sostenido erguido y recto.Nota: Los animales pueden ser refrenados manualmente como se muestra en el video. Si está disponible, el uso de un conducto de alpaca para refrenar las alpacas durante el sangrado y las inyecciones pueden facilitar el manejo. Para utilizar un conducto de alpaca, alpacas haltered condujo en el conducto y refrenados con cuello y correas con lanzamientos rápidos. El conducto de alpaca están disponibles de proveedores comerciales. Usando la proyección ventral de las apófisis transversas de las vértebras como una señal, ocluir la vena aplicando presión justo medial al proceso ventral.Nota: No hay ningún surco yugular distinto en alpaca adulto. Las venas yugulares están protegidas por las proyecciones ventrales de los procesos vertebrales transversales. Esta piel gruesa (por ejemplo, 1 cm de espesor “lucha contra la placa” sobre el 1/3 medio del cuello en los machos) y musculatura del cuello hace que sea difícil visualizar o palpar la vena yugular sí mismo. Posteriormente, el uso de hitos vertebrales es los indicadores más útiles de ubicación yugular. Inserte la aguja en un ángulo de 45° ligeramente medial (~ ancho del dedo) a la proyección hacia el centro del cuello. Manipular la aguja hasta que la sangre fluya.Nota: La vena yugular y arteria carótida están cerca uno del otro. Sangre venosa puede ser muy de color roja pero es aún más oscura que la sangre arterial. Después de la colección, se debe aplicar presión al sitio de 0.5-1 minutos (o más si se tiene acceso a la carótida) hasta que se asegura la hemostasia. Dibujar 4-10 mL de sangre con fines analíticos. Utilizar un 1,5 pulgadas, aguja de 20 G por lo general en conjunción con una jeringa de tamaño apropiado o tubo de la colección de sangre. Utilizar tubos de EDTA tapa K2de lavanda para recoger la sangre cuando los linfocitos de la purificación. Utilizar tubos de separación de suero superior oro (BD) al recoger la sangre para la producción de suero. Dibujar 50-100 mL de sangre para la producción. Utilice una extensión adicional de 12 pulgadas de infusión con un juego de infusión alado de 19-20 G “mariposa”.Nota: Una configuración de conjunto de extensión permite un asistente llenar varios tubos de sangre, lo que permite la venipuncturist concentrarse en estabilizar la aguja de la colección. La adición de la infusión acomoda movimiento potencial del animal (procedimiento de 3-5 min) y da una confortable distancia de trabajo para los operadores. Seguimiento inmunológico Tres o cuatro días después de la 3rd y 5 inyecciones deth , realizar un sangrado pequeño prueba de cada animal para obtener sueros para pruebas. Congelar y almacenar el suero en alícuotas de 0.5 mL. Obtener muestras de sangre adicional a la vez para monitorear la salud del animal, como hemos comentado anteriormente. Confirmar la presencia de anticuerpos específicos de antígenos por ELISA usando los sueros obtenidos de la prueba de sangra en momentos pre-inmune, tres semanas y cinco semanas. Es mejor tomar una purga final mientras sigue aumentando el título del anticuerpo. Generar placas de afinidad antígeno con superficie tratadas placas de 96 pocillos. Diluir 0.1 μg del antígeno en tampón de carbonato de sodio de 100 mM, pH 9.0. Añadir 100 μl de la solución en cada pocillo e incubar durante la noche a 4 ° C. Diez diluciones de cada antígeno se analizan por duplicado. Un control en blanco bien es preparado que está revestida con tampón de carbonato solamente. Después de la incubación durante la noche, invertir la placa para eliminar el contenido de los pocillos y lavar tres veces con 0,1 mL de PBS, 0,1% Tween 20 (PBS-T). Bloquean los pozos agregando 0,1 mL de BSA (5 mg/mL) en PBS-T y incubar la placa por 1 h a temperatura ambiente. Lave la placa tres veces con PBS-T pipetear la solución de lavado en el pozo y la solución de lavado por la inversión de la placa. Preparar diluciones seriadas dobles de 0,3 mL de cada uno de los sueros previamente inmunes e inmunes en el tampón de PBS-T utilizando una dilución inicial de 1/100 y hasta 1/102, 400. Añada 100 μl de cada dilución a los pocillos y dejar para incubar por 2 h a temperatura ambiente. Retire el suero de cada bien y lavar con 0,2 mL de PBS-T tres veces. Incubar cada uno con 0,1 mL de anticuerpo de IgG anti-llama cabra conjugado con HRP en una dilución de 1: 20.000 para 1 h.Nota: La respuesta inmune medida incluye tanto convencionales así como de la pesado-cadena solos anticuerpos, los cuales están presentes en proporciones aproximadamente iguales en circulación3,14. Retirar la solución de anticuerpo y lavar cada pozo con 0,2 mL de PBS-T tres veces. Añadir 100 μl de sustrato cromógeno de la peroxidasa al pozo e incubar a temperatura ambiente hasta que la intensidad de los dos puntos de concentración más altos han saturado, que generalmente toma 5-10 minutos. Añadir 100 μl de ácido sulfúrico de 0,1 M a cada pozo para detener la reacción. Medir la absorbancia de cada pocillo a 450 nm utilizando un lector de placas. Represente la absorbancia como una concentración de la función. Alpaca monitoreo y posibles complicaciones Asegúrese de alpaca adecuado monitoreo durante todo el procedimiento.Nota: Los procedimientos no deben causar efectos adversos significativos. Salud y el bienestar animal deben vigilarse diariamente por el personal de producción o investigación durante la alimentación y riego. Cualquier animal con morbosidad natural inducida experimentalmente o espontánea, unalleviated debe ser referido para la evaluación de servicios veterinarios con tratamientos como adecuados hasta eutanasia humanitaria, si es necesario.Potenciales consecuencias adversas asociadas con flebotomía son sangrado, contusión y hematoma. Los animales deben ser supervisados para que 20 min post sorteo de sangre buscar signos de sangrado. Puede usarse la presión adicional en los sitios. Si el sangrado no se detiene, debe contactar un veterinario.Otras consecuencias adversas potenciales asociados con las inyecciones y hemorragia incluyen inflamación y formación de granulomas. Formación de granulomas no se espera y no se ha observado en la Universidad de Kentucky. Inflamación del sitio de inyección (enrojecimiento o inflamación) puede ocurrir y debe ser traída a la atención de un veterinario. El sangrado de producción representa un volumen potencialmente significativo de sangre, y los animales deben ser supervisados para asegurarse de que son estables y activos después de la recolección de sangre.Anafilaxia y respuestas pirogénicas son las dos consecuencias adversas graves probablemente, pero se observan muy raramente. Si llegara a ocurrir, anafilaxia se produciría poco después de las inyecciones de antígeno y se manifiesta por un aumento en la temperatura rectal, debilidad, vómitos, problemas respiratorios y diarrea. Puede monitorizar temperatura rectal después de cada inyección para detectar cualquier aumento en la temperatura corporal. Si se reconocen, notifique a un veterinario inmediatamente para una consulta. Además, un “Crash Kit de la emergencia” (p. ej., epinefrina, corticosteroides y antihistamínicos) preparado en consulta con un médico veterinario debe estar disponible para tratar a los animales sospechados de tener una reacción adversa. 2. purificación de linfocitos para construcción de biblioteca de anticuerpos de dominio único Recoger 50 mL de sangre de tres a cinco días después de la última inyección (ver paso 1.4).Nota: Rápido procesamiento de la sangre y el aislamiento de ARN es importantes para obtener un tamaño de biblioteca adecuado15,3, que es muy importante para el éxito de la panorámica. Diluir 15 mL de la sangre recogida con 5 mL de PBS. Utilizar un tubo de la separación de linfocitos para aislar los linfocitos de sangre periférica (PBL) mediante la centrifugación de gradiente de densidad según sugerencias de la fabrica.PRECAUCIÓN: Las instrucciones del fabricante indican que puede utilizarse hasta 25 mL de sangre, pero esto puede saturar el sistema y evitar la obtención de una preparación de linfocitos limpio. Añadir 5 mL de PBS prechilled a 4 ° C a PBL. Vuelta por 20 min a 800 x g a 4 ° C. Lavar dos veces añadiendo 5 mL de PBS prechilled a 4 ° C a PBL seguido por centrifugación durante 20 min a 800 x g a 4 ° C. Aislar ARN total usando un sistema de centrifugado-columna base, según las instrucciones del fabricante. Homogeneizar las células por vertexing en tampón adecuado y aplicar un sistema de trituración de biopolímero. Utilizar un número adecuado de mini o maxi-columnas en la pila de entrada. Sintetizar el cDNA utilizando transcriptasa inversa mediante la combinación de 10 μg de ARN con una mezcla de 0.1 μg de Oligo (dT) 12-18 cartillas. Generar una biblioteca de bacteriófago usando métodos establecidos4. Se trata de clonación con enzimas de restricción en el phage display vector pMES4 seguido de la expresión de la inserción fusionada al gen III de los fagos filamentosos para la producción de la solución de fago. 3. dominio de un solo anticuerpo panorámica Placas de afinidad producir antígeno con superficie tratan placas de 96 pocillos. Diluir 0,25 μg del antígeno en tampón de carbonato de sodio de 100 mM, pH 9.0. Añadir 100 μl de esta solución en cada pocillo e incubar durante la noche a 4 ° C. Capa dos pozos por antígeno. Preparar un control en blanco bien de que está revestido con tampón de carbonato solamente.Nota: Placas pueden ser producidas y almacenadas hasta por una semana a 4 ° C si se realizarán varias rondas de selección. También, este método utiliza la absorción directa que no requiere de etiquetado mientras que otros métodos utilizan Biotinilación u otros tipos de estrategias de etiquetado. Incube la placa durante la noche. Invertir para eliminar el contenido de los pocillos y lavar tres veces con 0,1 mL de PBS-T. Bloquean los pozos agregando 0,1 mL de BSA (20 mg/mL) en PBS y incubar la placa por 2 h a temperatura ambiente. Lave la placa tres veces con PBS-T seguido por tres veces con PBS. Antígenos pueden también covalente etiquetados y utilizados en los sistemas de captura como, por ejemplo, sistemas de biotina/estreptavidina. Tratamiento previo para la solución de fago (100 μL) con 100 μl de 40 mg/mL de BSA en PBS en una plataforma vibratoria a temperatura ambiente durante 30 minutos. Añadir la solución de fago al antígeno cubierto pozos e incubar con agitación suave por 2 h a temperatura ambiente. Utilizar múltiples pozos con el fin de asegurar un total de 1011 phage para cada antígeno. Deseche el fago por inversión y lavar los pocillos 5 veces con 200 μL de PBS-T seguido por cinco veces con PBS. Eluir el phage enlazado mediante la adición de 0,1 mL de tripsina 0.25 mg/mL en PBS e incubar durante 30 min a temperatura ambiente en la plataforma vibratoria a 700 rpm. Transferir la solución a una frasco ampolla de 5 μl de solución de hydrochloride(AEBSF) 4 mg/mL 4-Bencenosulfonilo flúor para saciar la actividad de la tripsina. Crecer TG1 phage display competente las células a 37 ° C con agitación hasta OD600 = 0,5. Añada 50 μl del fago eluída a 3 mL de las células de TG1. Incubar a 37 ° C sin agitación durante 30 minutos. Agregar 7 mL de medio LB con ampicilina de 100 μg/mL, 2% glucosa. Agitar durante la noche a 37 ° C.Nota: Para obtener los más diversos anticuerpos de dominio único, clones secuenciados, probarlo para propiedades deseadas y utilizados después de una ronda de lavado. Para obtener la más alta afinidad de anticuerpos de dominio único, deben utilizarse dos rondas de bateo. Las bacterias de la placa después de una noche crecimiento en placas de LB agar suplementado con ampicilina de 100 μg/mL, 2% glucosa. Varias diluciones seriadas tendrá que ser probado, a partir de dos diluciones, plateando 100 μl de 1/10.000 y 1/100.000 diluciones. Incube la placa durante la noche a 37 ° C. Seleccionar las colonias e inocular los pocillos de una placa de 96 pocillos estéril conteniendo 100 μl de 2XYT con 100 μg/mL ampicilina, 2% glucosa, glicerol 10% v/v por pozo. Incubar durante una noche a 37 ° C sin agitación. Al día siguiente, agite a 170 rpm a 37 ° C durante 60 minutos. Quitar 2 μl del medio en tubos de PCR. La solución restante puede a la izquierda de la placa y almacenada a 4 ° C durante 1-2 días o congelada y almacenada a-80 ° C para su uso posterior. Realizar la reacción de polimerización en cadena usando las cartillas apropiados para el vector utilizado. PMES4, detección de PCR de clones positivos utiliza cebadores que flanquean el sitio de clonación múltiple es CCTATTGCCTACGGCAGCCGCTGGATTGTTATTAC y GGTGGTGTGAGGAGACGGTGACCTG. Utilizar bicicleta las condiciones apropiadas para la polimerasa utilizada, una recocido temperatura de 57 ° C y 30 ciclos. Analizar la reacción de PCR mediante la ejecución de un gel de agarosa al 1% (p/v). Colonias que son positivas tienen insertos de gene de anticuerpos de dominio único de ~ 500 BP Asegúrese de que los clones positivos son 20-50% de la muestra.Nota: Este método proporciona un medio para la copia, selección y análisis que pueden realizarse en laboratorios de investigación más. Alternativamente, secuenciación de próxima generación puede aplicarse y proporciona grandes conjuntos de datos que permiten el análisis estadístico y comparativo16. Inocular los clones positivos de la placa en frescos tubos con 7 mL de LB con ampicilina 100 de μg/mL. Crecer con agitación para pasar la noche a 37 ° C. Realizar una miniprep de la cultura para obtener DNA plasmídico. La secuencia de clones positivos mediante el estándar secuenciación primer pEX-Rev (CAGGCTTTACACTTTATGCTTCCGGC). Realizar análisis computacional en secuencias de anticuerpos de dominio único resultante. Asegúrese de que hay no hay codones de parada o cambios de marco. Clasificar las secuencias resultantes de la similitud y diversidad. Las secuencias que se identifican repetidas veces suelen ser secuencias de unión de alta afinidad, particularmente después de dos rondas de selección. Expresar los anticuerpos de dominio único usando una cepa BL21-deriva de la expresión de E. bobina. Inducir la expresión a través de la adición de IPTG, creciendo durante la noche a 22 ° C. Purificar los anticuerpos de dominio único mediante cromatografía de afinidad metálica inmovilizados (IMAC). Validar la Unión de anticuerpo/antígeno único dominio usando un análisis de interacción directa como electroforesis nativa, abatible, o ELISA. Comprobar el rendimiento de anticuerpos de dominio específico de la aplicación, como se desee para el experimento específico.