Immunisation des alpaga (Lama pacos) avec les antigènes protéiques et de la Production d’anticorps spécifiques de l’antigène unique

Toutes les procédures avec les alpagas ont été réalisés conformément aux protocoles (2627-2017 et 2018-2925) approuvés par l’Université du Kentucky institutionnels et animalier utilisation Comité (IACUC). 1. production d’anticorps spécifiques de l’antigène Alpaca Gestion d’alpaga et considérations générales Obtenir l’approbation institutionnelle et/ou réglementaire appropriée. Obtenir des alpagas adultes, moins de 10 ans avec un corps condition score d’au moins 3,0 (échelle 1-5)12. Parce qu’ils sont les animaux du troupeau, la maison un minimum de deux mais de préférence trois animaux ensemble.Remarque : Les mâles sont recommandés car, en général, ils ont un tempérament plus uniforme et plus faciles à travailler avec. Vérifier l’état de santé des animaux à travers un examen vétérinaire, y compris l’examen du régime alimentaire, le logement, la vaccination et le parasite contrôle programmes13. Veiller à ce que les animaux sont à jour avec les vaccins appropriés à la région géographique locale fondée sur les recommandations professionnelles de vétérinaires. Élaborer un programme de contrôle d’ecto – et endoparasite en consultation avec un vétérinaire fondée sur un examen de l’histoire du troupeau d’origine et les conditions locales spécifiques,13. S’acclimater pendant au moins une semaine, y compris la formation de licol et l’exposition à la retenue. Prélever un échantillon de sang de 4 mL pour obtenir le sérum destiné à un contrôle avant la vaccination (voir étape 1.4). Geler les sérums et les conserver à-20 ° C en aliquotes de 0,5 mL.Remarque : En ce temps, sang supplémentaire peut être prise pour une analyse complète des globules (CBC) surveiller l’état de santé initial des animaux. Préparation de l’antigène Préparer les antigènes de protéines purifiées dans une solution saline tamponnée au phosphate (PBS) ou une solution saline tamponnée HEPES (HBS) et se concentrer à ≥ 1 mg/mL. Il faut environ 3 mg de protéine pour le protocole complet, y compris la vaccination, panoramique et confirmation de clones.Remarque : Anticorps de camélidés affichent grande spécificité et sélectivité contre les antigènes protéiques mais ne sont généralement pas bien adaptés pour des protéines non structurés ou antigènes peptidiques qui sont généralement non structurées. Pureté de l’antigène, avec une pureté > 90 % désiré. Utiliser une méthode d’analyse tels que SDS-PAGE.Mise en garde : Contamination importante avec d’autres protéines peut conduire à des problèmes lors de la sélection où les anticorps à domaine unique peuvent être isolés de contaminants plutôt que de la protéine cible. Préparer des aliquotes congelés d’antigène qui contient un total de 100 µg d’antigène. 50 µL d’une préparation de 2 mg/mL est idéal. 100 µL de 1 mg/mL est la solution de protéines plus diluée appropriée pour la vaccination. Par ailleurs, si l’antigène ne peuvent pas subir de gel/dégel et est considérée comme stable à long terme de solution, il peut être conservé à 4 ° C.Remarque : Afin d’assurer que l’antigène peut subir un cycle de gel/dégel, test qu’une quantité de 20 µL de l’antigène devrait être distribuée dans une mince paroi tube PCR et snap congelés dans l’azote liquide. Décongeler le tube, d’exécuter la centrifugation à haute vitesse et vérifier la récupération quantitative en comparant l’absorption d’UV/VIS avant et après la congélation ou en exécutant un gel SDS-PAGE. Si c’est possible, l’antigène doit également être testé pour le maintien de l’activité biologique. Si le cycle de gel dégel est réussi, l’antigène restant est clin d’oeil gelé dans 100 µL d’extraits et conservés à-80 ° C. S’il y a des problèmes avec le cycle de gel/dégel, le protocole peut être répété avec l’ajout de jusqu’à 20 % de glycérol. Vaccination Mélanger jusqu’à cinq antigènes, 200 µg chaque, avec adjuvant dans un volume final d’entre 300 à 1 000 µL. L’adjuvant devrait constituer ≥50 % du volume final utilisant l’eau comme le diluant.Remarque : Si le tampon est nécessaire, utilisez HEPES, MOPS ou la glycine. Un pH compris entre 5 et 6 s’est souvent avéré pour être plus favorable que strictement neutre. Évitez les ions polyvalents tels que le phosphate ou le citrate, car ils peuvent provoquer la coagulation. Couper les cheveux de l’alpaga avec une tondeuse électrique, en forme de croissant de lune le long de son cou épaule à épaule pour exposer les régions adjacentes aux proue des ganglions de la base. L’alpaga en tenant par le cou, injecter lentement l’antigène sous la peau le long de la base du cou près des proue ganglions lymphatiques à l’aide d’une aiguille de 22 G. Effectuer cinq injections de ~ 200 µL (ou moins) ~ 5 cm de distance.Remarque : Les animaux devraient être freinée par un deuxième membre du personnel pendant les injections. Injection et saignements alpagas appelle à la prudence car elles sont sujettes aux coups de pied, pas juste par derrière, mais sur le côté. Avoir les animaux proches entre eux, dans un groupe, lors de la procédure est optimale. Étant donné qu’ils sont les animaux du troupeau, ils sont plus calmes dans un groupe et moins vigoureux retenue est nécessaire pendant les procédures. Surveiller les animaux pour ~ 20 min après injection des signes d’anaphylaxie (voir étape 1.6). Moniteur pour inflammation localisée sur les sites d’injection hebdomadaire, qui ne devrait pas lors de l’utilisation de l’adjuvant recommandé. Veiller à ce que la fuite de sang du site d’injection n’est pas excessive. Effectuer cinq injections boosting ultérieures par semaine à l’aide de 100µg de chaque antigène dans le mélange. Tondre les cheveux sur les sites d’injection peut être exigée par semaine selon la saison. En automne et en hiver, les cheveux de l’animal peut se développer rapidement. Sang d’encre Clip et désinfecter le site de collection avec des tampons d’alcool. Retenir l’animal doucement avec le cou qui s’est tenue debout et droite.Remarque : Les animaux peuvent être immobilisés manuellement comme montré dans la vidéo. Si disponible, utiliser une goulotte d’alpaga pour retenir les alpagas lors de saignements et des injections peuvent faciliter la manutention. Pour utiliser une goulotte d’alpaga, licou alpagas sont dirigés dans la goulotte et sobre avec barres de cou et bracelets avec blocages. Versions de la goulotte d’alpaga sont disponibles auprès de fournisseurs commerciaux. En utilisant la projection ventrale de l’apophyse transverse des vertèbres comme un point de repère, occlure la veine en appliquant une pression juste médiale du processus ventrale.Remarque : Il n’y a aucun sillon jugulaire distincte en alpaga adulte. Les veines jugulaires sont protégés par les saillies ventrales des processus transverses vertébrales. Cette peau épaisse (p. ex., 1 cm d’épaisseur « disputent plaque » le 1/3 moyen du cou chez les mâles) et la musculature de la nuque, il est difficile de visualiser ou de palper la veine jugulaire lui-même. Par la suite, l’utilisation des points de repère vertébrales est les indicateurs très utiles pour emplacement jugulaire. Insérer l’aiguille à un angle de 45° légèrement médial (~ largeur de doigt) pour la projection vers le centre de la nuque. Manipuler l’aiguille jusqu’à ce que le sang coule.Remarque : La veine jugulaire et l’artère carotide sont rapprochées. Le sang veineux peut être tout à fait rouge en couleur mais est encore plus sombre que le sang artériel. Suite à la collection, la pression doit être appliquée au site de 0,5 à 1 min (ou plus longtemps si la carotide est accessible) jusqu’à ce que l’hémostase est assurée. Dessiner 4 à 10 mL de sang aux fins d’analyses. Utiliser un 1,5 pouce, aiguille 20 G généralement en conjonction avec une seringue de taille appropriée ou le tube de prélèvement de sang. Utiliser les tubes haut K2EDTA de lavande pour recueillir le sang lors de l’épuration des lymphocytes. Utiliser des tubes de séparation de sérum albums or (BD) lors de la collecte du sang pour la production de sérum. Attirer 50-100 mL de sang à des fins de production. Utiliser une extension de perfusion supplémentaire de 12 pouces serti d’une perfusion de 19-20 G ailé « papillon ».Remarque : Une configuration set extension permet un assistant remplir plusieurs tubes de prélèvement sanguin, ce qui permet du venipuncturist de se concentrer sur la stabilisation de l’aiguille de la collection. L’addition de l’ensemble de perfusion peut accueillir un mouvement potentiel de l’animal (3-5 min procédure) et donne une distance de travail confortable pour les opérateurs. Immunitaire de surveillance Trois ou quatre jours après les 3rd et 5ème injections, effectuer une purge de petit test de chaque animal pour obtenir sérums pour le test. Congeler et stocker les sérums en aliquotes de 0,5 mL. Obtenir des échantillons de sang supplémentaire dans le même temps de surveiller la santé de l’animal, tel que discuté ci-dessus. Confirmer la présence d’anticorps spécifiques de l’antigène par ELISA utilisant les sérums prélevés test saignements aux points de temps préalablement immunisée, trois semaines et cinq semaines. Il est préférable de prendre une purge finale tandis que le titre des anticorps augmente toujours. Générer des plaques d’affinité antigène à l’aide de la surfaces traitées plaques de 96 puits. Diluer à 0,1 µg de l’antigène dans un tampon de carbonate de sodium 100 mM, pH 9,0. Ajouter 100 µL de la solution dans chaque puits et incuber une nuit à 4 ° C. Les dix dilutions de chaque antigène sont testées en double exemplaire. Un contrôle à blanc est bien préparé qui est recouvert d’un tampon de carbonate seulement. Après l’incubation durant la nuit, inverser la plaque pour retirer le contenu des puits et laver trois fois avec 0,1 mL de PBS, 0,1 % de Tween 20 (PBS-T). Bloquer les puits en ajoutant 0,1 mL de BSA (5 mg/mL) en PBS-T et en incubant la plaque pendant 1 h à température ambiante. Laver les plaques trois fois avec PBS-T en pipettant également, la solution de lavage dans le puits puis supprimer la solution de lavage par l’inversion de la plaque. Préparer des dilutions en série double de 0,3 mL chacun des sérums préalablement immunisés et immunitaires dans le tampon PBS-T en utilisant une dilution de départ de 1/100 et jusqu’au 1/102, 400. Ajouter 100 µL de chaque dilution dans les puits et laisser pour incuber pendant 2 h à température ambiante. Retirez le sérum de chaque puits et laver avec 0,2 mL de PBS-T trois fois. Incuber à chacun bien avec 0,1 mL d’anticorps de type IgG anti-Lama chèvre HRP conjugué à une dilution de 1/20 000 pendant 1 h.Remarque : L’immuno-réaction mesurée inclut à la fois classiques ainsi que des anticorps seules chaîne lourde, qui sont présents dans des proportions approximativement égales en circulation3,14. Enlever la solution de l’anticorps et laver chaque puits avec 0,2 mL de PBS-T trois fois. Ajouter 100 µL de substrat chromogène de PEROXY dans le puits et incuber à température ambiante jusqu’à ce que l’intensité des deux points culminants concentration ont devenir saturé, qui dure entre 5-10 min. Ajouter 100 µL d’acide sulfurique 0,1 M à chaque puits pour arrêter la réaction. Mesurer l’absorbance de chaque puits à 450 nm en utilisant un lecteur de plaque. Reporter l’absorbance comme une concentration de fonction. Complications potentielles et de surveillance alpaga S’assurer que l’alpaga approprié suivi tout au long de la procédure.Remarque : Les procédures ne devraient pas causer des effets indésirables importants. Santé et bien-être des animaux doivent être surveillées quotidiennement par le personnel de l’élevage et/ou la recherche pendant alimentation et d’abreuvement. Tout animal avec unalleviated morbidité naturelle spontanée ou induite expérimentalement devrait être soumise à l’évaluation par les services vétérinaires avec traitements fournis le cas échéant, jusqu’à l’euthanasie humaine, si nécessaire.Des conséquences préjudiciables possibles associés à la phlébotomie sont des saignements, ecchymoses et hématomes. Les animaux doivent être surveillés pour 20 min poste sang tirage chercher les signes d’hémorragie. Une pression supplémentaire sur les sites doit être utilisée. Si le saignement ne s’arrête pas, un vétérinaire doit être contacté.Autres conséquences indésirables associés à des injections et des saignements incluent l’inflammation et la formation de granulome. Formation de granulome ne devrait pas et n’a pas été observée à l’Université du Kentucky. Injection site inflammation (rougeur ou enflure) pourrait se produire et doit être portée à l’attention d’un vétérinaire. La purge de production représente un volume de sang potentiellement important, et les animaux doivent être surveillés pour s’assurer qu’ils sont stables et actif après la collecte de sang.Anaphylaxie et réponses pyrogènes sont les deux conséquences préjudiciables graves plus probables, mais sont très rarement observés. Si elle devait se produire, anaphylaxie produirait peu de temps après l’injection de l’antigène et se manifester par une augmentation de la température rectale, faiblesse, vomissements, problèmes respiratoires, ou de diarrhée. La température rectale peut être surveillée après chaque injection, afin de déceler toute augmentation de la température corporelle. Si ceux-ci sont reconnus, prévenir un vétérinaire immédiatement pour une consultation. En outre, une trousse d’urgence « Crash » (p. ex., épinéphrine, corticoïdes et antihistaminiques) préparé en consultation avec un vétérinaire devrait être disponible pour traiter les animaux suspectés d’avoir un effet indésirable. 2. purification des Lymphocytes à domaine unique anticorps bibliothèque Construction Recueillir 50 mL de sang trois à cinq jours après la dernière injection (voir étape 1.4).Remarque : Un traitement rapide du sang et l’isolement de l’ARN sont importants obtenir une bibliothèque convenable taille15,3, qui est très important pour la réussite du panoramique. Diluer 15 mL de sang prélevé avec 5 mL de PBS. Utiliser un tube de séparation de lymphocytes pour isoler des lymphocytes du sang périphérique (LSP) par centrifugation en gradient de densité selon les suggestions de produits manufacturés.Mise en garde : Instructions du fabricant indiquent que jusqu’à 25 mL de sang peuvent être utilisés, mais cela peut saturer le système et éviter l’obtention d’une préparation propre lymphocytaire. Ajouter 5 mL de PBS prérefroidies à 4 ° C à PBL. Tournez pendant 20 min à 800 x g à 4 ° C. Laver deux fois en ajoutant 5 mL de PBS prérefroidies à 4 ° C à PBL suivie à la centrifugation pendant 20 min à 800 x g à 4 ° C. Isoler l’ARN total en utilisant un système de spin-colonne basée, selon les instructions du fabricant. Homogénéiser les cellules en vertexing dans un tampon approprié et application à un système de déchiquetage de biopolymère. Utilisez un nombre approprié de mini ou maxi-colonnes qui dépend de la cellule d’entrée. Synthèse de cDNA utilisant transcriptase inverse en combinant 10 µg d’ARN avec un mélange de 0,1 µg d’Oligo (dT) 12-18 amorces. Générer une bibliothèque de bactériophage à l’aide de méthodes reconnues4. Cela implique le clonage avec des enzymes de restriction dans le phage display vecteur pMES4 suivie de l’expression de l’insert fusionné au gène III du phage filamenteux pour la production de la solution du phage. 3. simple domaine anticorps panoramique Produire l’antigène affinité plaques sur la surface traitement plaques à 96 puits. Diluer 0,25 µg de l’antigène dans un tampon de carbonate de sodium 100 mM, pH 9,0. Ajouter 100 µL de cette solution dans chaque puits et incuber une nuit à 4 ° C. Enduire les deux puits par antigène. Préparer un contrôle à blanc bien qui est recouvert d’un tampon de carbonate seulement.Remarque : Plaques peuvent être produites et stockées pendant une semaine à 4 ° C si plusieurs cycles de sélection seront effectuées. En outre, cette méthode utilise absorption directe ne nécessitant pas de marquage tandis que d’autres méthodes utilisent biotinylation ou autres types de stratégies d’étiquetage. Incuber les plaques jusqu’au lendemain. Inverser pour supprimer le contenu des puits et laver trois fois avec 0,1 mL de PBS-T. Bloquer les puits en ajoutant 0,1 mL de BSA (20 mg/mL) dans du PBS et incuber la plaque pendant 2 h à température ambiante. Laver les plaques trois fois avec PBS-T suivie par trois fois avec du PBS. Antigènes peuvent également être étiquetés et utilisés dans les systèmes de capture comme, par exemple, les systèmes de streptavidine/biotine de façon covalente. Prétraitez la solution phage (100 µL) avec 100 µL de BSA 40 mg/mL dans du PBS sur une plate-forme vibrante à température ambiante pendant 30 min. Ajouter la solution de phage à l’antigène enduit puits et incuber à une agitation modérée pendant 2 h à température ambiante. Utilisez plusieurs puits afin d’assurer un total de 1011 phage pour chaque antigène. Jeter le phage indépendant par inversion et puis laver les puits cinq fois avec 200 µL de PBS-T suivie cinq fois avec du PBS. Éluer le phage lié en ajoutant 0,1 mL de trypsine de 0,25 mg/mL dans du PBS et incuber pendant 30 min à température ambiante sur la plate-forme vibrante à 700 tr/min. Transvaser la solution dans un flacon contenant 5 µL de solution de hydrochloride(AEBSF) 4 mg/mL 4-benzènesulfonyle fluorure pour étancher l’activité de la trypsine. La croissance de TG1 phage affichage cellules compétentes à 37 ° C sous agitation jusqu’à OD600 = 0,5. Ajouter 50 µL de phage éluée dans 3 mL de cellules TG1. Incuber à 37 ° C sans agitation pendant 30 min. Ajouter 7 mL de LB milieux enrichis avec de l’ampicilline 100 µg/mL, 2 % de glucose. Agiter pendant une nuit à 37 ° C.Remarque : Pour obtenir les plus divers anticorps de domaine unique, clones peuvent être séquencés, mis à l’essai pour les propriétés souhaitées et utilisés après un tour de panoramique. Pour obtenir la plus haute affinité anticorps à domaine unique, deux séries de panoramique doivent être utilisées. Plaque de la bactérie après qu’une nuit croissance sur gélose LB additionné de l’ampicilline 100 µg/mL, 2 % de glucose. Plusieurs dilutions successives devront être testés, commençant par deux dilutions, plaquant 100 µL de 1/10 000 et 1/100 000 des dilutions. Incuber la plaque pendant une nuit à 37 ° C. Prélever les colonies et l’inoculer les puits d’une plaque de 96 puits stérile contenant 100 µL de 2XYT avec 100 ampicilline µg/mL, 2 % de glucose, glycérol 10 % v/v / puits. Incuber une nuit à 37 ° C sans agitation. Le lendemain, agiter à 170 tr/min à 37 ° C pendant 60 min. Retirer 2 µL de médias dans des tubes PCR. Le reste de la solution peut être laissé dans l’assiette et stocké à 4 ° C pendant 1 à 2 jours ou congelé et stocké à-80 ° C pour une utilisation ultérieure. Effectuer la réaction de PCR utilisant des amorces appropriées pour le vecteur utilisé. Pour pMES4, dépistage de la PCR de clones positifs utilise des amorces qui entourent le site multiple de clonage est CCTATTGCCTACGGCAGCCGCTGGATTGTTATTAC et GGTGGTGTGAGGAGACGGTGACCTG. Utiliser les cyclistes des conditions appropriées pour la polymérase utilisée, une température de recuit de 57 ° C et 30 cycles. Analyser la réaction PCR en exécutant un gel d’agarose de 1 % (p/v). Les colonies qui sont positifs ont seul domaine anticorps gène insertions de ~ 500 BP. veiller à ce que les clones positifs sont 20 à 50 % de l’échantillon.Remarque : Cette méthode fournit un moyen de clone de sélection et analyse qui peut être effectuée dans la plupart des laboratoires de recherche. Sinon, séquençage de prochaine génération peut être appliqué et fournit de grands ensembles de données qui permettent l’analyse statistique et comparative,16. Ensemencer les clones positifs de la plaque douce tubes contenant 7 mL de LB avec de l’ampicilline 100 µg/mL. Grandir avec la secousse pendant une nuit à 37 ° C. Effectuer un miniprep sur la culture pour obtenir l’ADN de plasmide. La séquence des clones positifs en utilisant la norme séquençage apprêt pEX-Rev (CAGGCTTTACACTTTATGCTTCCGGC). Effectuer une analyse computationnelle sur des séquences d’anticorps domaine unique qui en résulte. S’assurer qu’il n’y a aucun codons stop ou cadre se déplace. Classer les séquences résultantes de similarité et de diversité. Les séquences qui sont identifiés à plusieurs reprises sont plus susceptibles d’être des séquences de liaison de haute affinité, particulièrement après deux tours de sélection. Exprimer l’anticorps seul domaine utilisant une souche dérivée BL21 expression du bobine e. Induire l’expression grâce à l’ajout d’IPTG, de plus en plus du jour au lendemain à 22 ° C. Purifier l’anticorps seul domaine à l’aide de la chromatographie d’affinité métallique immobilisée (IMAC). Valider la liaison d’anticorps/antigène domaine unique à un dosage d’interaction directe comme l’électrophorèse sur gel de menu déroulant, natif ou ELISA. Vérifier la performance des anticorps spécifiques à l’application de domaine unique, comme vous le souhaitez pour l’expérience spécifique.