Immunisatie van alpaca's (Lama pacos) met eiwit antigenen en productie van antigeen-specifieke enkel domein antilichamen

Alle procedures met de alpaca’s werden verricht overeenkomstig de protocollen (2627-2017 en 2018-2925) goedgekeurd door de Universiteit van Kentucky institutionele Animal Care en gebruik Comité (IACUC). 1. generatie van antigeen-specifieke Alpaca antilichamen Alpaca handling en algemeneoverwegingen Passende institutionele en/of wettelijke goedkeuring te verkrijgen. Verkrijgen van volwassen Alpaca’s, minder dan 10 jaar oud met een lichaam conditie score van ten minste 3.0 (schaal 1-5)12. Omdat ze kuddedieren zijn, huis minimaal twee maar bij voorkeur drie dieren samen.Opmerking: Mannetjes worden aanbevolen, omdat, in het algemeen, ze hebben een meer gelijkmatige temperament en zijn gemakkelijker mee kunt werken. Controleer de gezondheidsstatus van dieren door middel van een veterinair onderzoek met inbegrip van de herziening van de voeding, huisvesting, vaccinatie en parasiet controle programma’s13. Ervoor zorgen dat de dieren up to date met vaccinaties worden de geografische streek op basis van professionele veterinaire aanbevelingen zijn. Ontwikkelen van een besturingsprogramma ecto- en endoparasite in overleg met een dierenarts die is gebaseerd op een beoordeling van de geschiedenis van het beslag van oorsprong en de specifieke plaatselijke omstandigheden13. Acclimatiseren voor ten minste een week, met inbegrip van de halter training en blootstelling aan terughoudendheid. Verzamelen van een bloedmonster 4 mL om te verkrijgen van serum voor gebruik als een pre immunisatie besturingselement (zie stap 1.4). Bevriezen van de sera en opgeslagen bij-20 ° C in 0,5 mL aliquots.Opmerking: Op dit moment kan extra bloed worden genomen voor een analyse van de volledige bloedcel (CBC) om te controleren eerste gezondheidsstatus van de dieren. Antigeen voorbereiding Bereiden van gezuiverde eiwit antigenen in-fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS) of HEPES-gebufferde zoutoplossing (HBS) en zich concentreren op ≥1 mg/mL. Ongeveer 3 mg van eiwit is nodig voor het volledige protocol, met inbegrip van de immunisering, pannen en bevestiging van klonen.Opmerking: Kameelachtige antilichamen hoge specificiteit en selectiviteit tegen eiwit antigenen worden weergegeven, maar zijn over het algemeen niet geschikt voor ongestructureerde proteïnen of peptide antigenen die over het algemeen ongestructureerde. Stellen van antigeen zuiverheid, met zuiverheid > 90% gewenst. Gebruik een analytische methode zoals SDS-pagina.Let op: Significante besmetting met andere eiwitten kan leiden tot problemen bij de selectie waar enkel domein antilichamen kunnen worden geïsoleerd aan contaminanten in plaats van het target-eiwit. Bevroren aliquots van het antigeen die een totaal van 100 µg antigen bevat voor te bereiden. 50 µL van een preparaat van 2 mg/mL is ideaal. 100 µL van 1 mg/mL is de meest verdunde oplossing van eiwit geschikt voor immunisatie. Als alternatief, als het antigeen kan niet ondergaan vorst/dooi en is bekend om zijn stabiel op lange termijn van de oplossing, het kan worden opgeslagen bij 4 ° C.Opmerking: Om ervoor te zorgen dat het antigeen kan ondergaan een vorst/dooi cyclus, ommuurde test die een aliquot 20 µL van het antigeen moet worden verstrekt in een dunne PCR buis en module ingevroren in vloeibare stikstof. Ontdooien van de buis, hoge snelheid centrifugeren uitvoeren en controleren van het kwantitatieve herstel door het vergelijken van de absorptie van UV/VIS vóór en na de bevriezing of door het runnen van een SDS-pagina gel. Indien mogelijk, moet het antigeen ook voor het behoud van de biologische activiteit worden getest. Als de vries-dooi cyclus geslaagd is, is de resterende antigeen module in 100 µL aliquots bevroren en opgeslagen bij-80 ° C. Als er problemen zijn met de vorst/dooi cyclus, het protocol kan worden herhaald met de toevoeging van maximaal 20% glycerol. Immunisatie Maximaal vijf antigenen, 200 µg per stuk, mix met adjuvans in een eindvolume van tussen de 300 tot 1000 µL. De adjuvante moet vormen ≥50% van het uiteindelijke volume, gebruik van water als het oplosmiddel.Opmerking: Als buffer nodig is, gebruikt HEPES, MOPS, of glycine. Een pH tussen 5 en 6 is vaak gunstiger dan strikt neutraal gebleken. Vermijd polyvalente ionen zoals fosfaat of citraat, aangezien ze de stolling kunnen provoceren. Versiering van de alpaca haren met elektrische tondeuse, in een patroon van de wassende maan langs de basis van haar hals vanaf de schouder aan schouder bloot van de regio’s grenzend aan de lymfklieren van de boog. Houd de alpaca door de nek en injecteren langzaam het antigeen subcutaan langs de onderkant van de hals in de buurt van de lymfklieren van de boog met behulp van een naald 22 G. Uitvoeren van vijf injecties van ~ 200 µL (of minder) ~ 5 cm uit elkaar.Opmerking: De dieren moeten worden gefixeerd door een tweede personeelslid tijdens de injecties. Injecteren en bloeden Alpaca’s oproepen tot voorzichtigheid omdat ze gevoelig zijn voor schoppen, niet alleen van achter maar zijwaarts. Waar de dieren dicht bij elkaar, in een groep, tijdens de procedures is optimaal. Gezien het feit dat ze kuddedieren zijn, ze zijn rustiger in een groep en minder krachtig terughoudendheid nodig is tijdens de procedures. Controleren van de dieren voor ~ 20 min post injectie voor tekenen van anafylaxie (zie stap 1.6). Monitor voor gelokaliseerde ontsteking op de injectie sites wekelijks, die niet te verwachten is bij het gebruik van de aanbevolen adjuvans. Zorg ervoor dat het lekken van bloed uit de plaats van injectie niet buitensporig. Uitvoeren van vijf daaropvolgende stimuleren injecties wekelijks met behulp van 100 µg voor elk antigeen in het mengsel. Knippen van de haren op de sites van de injectie kan worden verlangd wekelijks afhankelijk van het seizoen. In de herfst en winter, kan de dieren haren groeien snel. Tekening bloed Clip en desinfecteren van de collectie site met alcohol swabs. Beperken het dier voorzichtig met de nek rechtop gehouden en rechtdoor.Opmerking: Dieren kunnen handmatig zoals aangetoond in de video worden gefixeerd. Indien beschikbaar, gebruik van een parachute alpaca de alpaca’s beperken tijdens het verbloeden en injecties behandeling kunnen verlichten. Als u een alpaca-parachute zijn, haltered Alpaca’s leidde naar de parachute en gefixeerd met nek bars en riemen met snelle releases. Versies van de alpaca parachute zijn beschikbaar via commerciële leveranciers. Met behulp van de ventrale projectie van de transverse-proces van de wervels als een mijlpaal, occlude de ader door gewoon mediale druk aan het ventrale proces toe te passen.Opmerking: Er is geen afzonderlijke jugular furrow in volwassen alpaca. De jugular veins worden beschermd door de ventrale projecties van de dwarse Vertebrale processen. Deze dikke huid (bijvoorbeeld 1 cm dik “fighting plaat” over de middelste 1/3 van de hals bij mannen) en nek spieren maakt het moeilijk om te visualiseren of palperen van de halsslagader zelf. Vervolgens is het gebruik van Vertebrale bezienswaardigheden is de meest nuttige indicatoren voor jugular locatie. Invoegen van de naald onder een hoek van 45° iets mediaal (~ breedte vinger) naar de projectie naar het midden van de nek. Het manipuleren van de naald tot de stromen van het bloed.Opmerking: De halsslagader en de halsslagader liggen dicht bij elkaar. Veneuze bloed kan heel rood in de kleur maar nog steeds donkerder is dan de arteriële bloed. Naar aanleiding van de collectie, druk moet worden toegepast op de site voor 0,5-1 min (of langer indien de halsslagader wordt benaderd) totdat hemostase is verzekerd. 4-10 mL bloed trekken voor analytische doeleinden. Gebruik maken van een 1,5 inch, 20 G naald meestal in combinatie met een passende formaat spuit of blood collection tube. Gebruik van lavendel top K2EDTA buizen voor het verzamelen van de volbloed wanneer zuiveren van lymfocyten. Gouden top serum scheiding buizen (BD) gebruiken bij het verzamelen van het bloed voor de productie van serum. Tekenen van 50-100 mL bloed voor productiedoeleinden. Gebruikt u een extensie van de extra 12-inch infusie set een gevleugelde 19-20 G “butterfly” infusie.Opmerking: Een extensie instellen configuratie kunt assistent te vullen meerdere bloed collectie buizen, zodat de venipuncturist zich te concentreren op het stabiliseren van de collectie naald. De toevoeging van de infusie set herbergt potentiële verkeer van het dier (3-5 min procedure) en geeft een comfortabele afstand voor de exploitanten. Immuun toezicht Drie tot vier dagen na de 3rd en 5th injecties, een kleine test afloop van elk dier te verkrijgen van sera voor het testen uitvoeren. Bevriezen en bewaar de sera op 0,5 mL aliquots. Extra bloedmonsters krijgen op hetzelfde moment te houden op de gezondheid van het dier, zoals hierboven besproken. De aanwezigheid van antigeen-specifieke antilichamen door ELISA met behulp van de sera test aflopen op vooraf immuun, drie weken durende en vijf weken tijd punten verkregen te bevestigen. Het is best om een definitieve afloop terwijl de antilichaam titer neemt nog steeds toe. Genereren van antigeen affiniteit platen met behulp van oppervlakte behandelde 96-wells-platen. Verdun 0,1 µg van het antigeen in 100 mM natriumcarbonaat buffer, pH 9.0. Voeg 100 µL van de oplossing aan elk putje en na een nacht bebroeden bij 4 ° C. Tien verdunningen voor elk antigeen worden getest in tweevoud. Een blanco-controle is goed voorbereid dat is bedekt met carbonaat buffer alleen. Na een incubatieperiode van de overnachting, het omkeren van de plaat om te verwijderen van de inhoud van de putten en was driemaal met 0,1 mL PBS, 0,1% Tween-20 (PBS-T). Blokkeren de putten door toevoeging van 0,1 mL BSA (5 mg/mL) in PBS-T en de plaat gedurende 1 uur bij kamertemperatuur incuberen. De plaat driemaal met PBS-T wassen door pipetteren de wash-oplossing in de put en vervolgens het verwijderen van de wash-oplossing door de inversie van de plaat. Maak van twee-voudige seriële verdunningen van 0.3 mL elk van pre immuun en immuun sera in PBS-T buffer met behulp van een startende verdunning van 1/100, en tot 1/102, 400. Breng 100 µL van elke verdunning in de putjes en laat gedurende 2 uur bij kamertemperatuur incuberen. Het serum te verwijderen van elk putje en wassen met 0,2 mL PBS-T driemaal. Incubeer elk goed met 0,1 mL van HRP-geconjugeerde geit anti-llama IgG antilichamen bij een verdunning 1:20,000 gedurende 1 uur.Opmerking: De immuunrespons gemeten omvat zowel conventionele alsmede enige zware-keten antilichamen, die in ongeveer gelijke verhoudingen in omloop3,14aanwezig zijn. De antilichaam-oplossing verwijderen en wassen elk goed met 0,2 mL PBS-T driemaal. Voeg 100 µL chromogenic peroxidase substraat naar de waterput en Incubeer bij kamertemperatuur totdat de intensiteit van de twee hoogste concentratie punten hebben verzadigd, wat gewoonlijk duurt 5-10 min. Voeg 100 µL van 0,1 M zwavelzuur aan elk putje te stoppen met de reactie. Meet de extinctie van elk putje bij 450 nm met behulp van een afleesapparaat. Plot de extinctie als de concentratie van een functie. Alpaca monitoring en mogelijke complicaties Zorgen voor passende alpaca toezicht gedurende de hele procedure.Opmerking: De procedures zijn niet verwacht aanzienlijke schadelijke effecten. Dierlijk welzijn en gezondheid moeten worden toegezien dagelijks door veeteelt en/of onderzoek personeel tijdens het voederen en drenken. Een dier met unalleviated experimenteel-geïnduceerde of spontane natuurlijke morbiditeit moet voorleggen voor de evaluatie veterinaire diensten met treatment(s) verstrekt in voorkomend geval, tot het humane euthanasie, indien nodig.Mogelijke negatieve gevolgen phlebotomy gekoppeld zijn bloedingen, kneuzingen en hematoom. De dieren moeten worden gecontroleerd voor 20 min post bloed trekken op zoek naar de tekenen van bloeden. Extra druk op de sites moet worden gebruikt. Als het bloeden niet stopt, kan een dierenarts moet worden gecontacteerd.Andere mogelijke negatieve gevolgen die samenhangen met injecties en bloeden omvatten granuloma vorming en ontsteking. Granuloma vorming is niet te verwachten en niet waargenomen aan de Universiteit van Kentucky. Injectie site ontsteking (roodheid of zwelling) kan optreden, en onder de aandacht van een dierenarts moet worden gebracht. De afloop van de productie vertegenwoordigt een potentieel aanzienlijk volume aan bloed, en de dieren moeten worden gecontroleerd om te verzekeren dat ze stabiel en actief na de bloedinzameling zijn.Anafylaxie en pyrogene reacties zijn de twee meest waarschijnlijk ernstige nadelige gevolgen, maar zeer zelden in acht worden genomen. Als het zou voordoen, anafylaxie zou optreden kort na de antigeen-injecties en worden geopenbaard door een toename van de rectale temperatuur, zwakte, braken, ademhalingsproblemen en/of diarree. Rectale temperatuur kan worden gecontroleerd na elke injectie te detecteren een stijging in lichaamstemperatuur. Als deze worden herkend, kennis van een dierenarts onmiddellijk voor een consult. Bovendien, moet een noodsituatie “Crash Kit” (bijvoorbeeld adrenaline, corticosteroïden en antihistaminicum) voorbereid in overleg met een dierenarts openstaan voor de behandeling van dieren waarbij een bijwerking waarvan wordt vermoed. 2. het zuiveren van lymfocyten voor één domein antilichaam bibliotheek bouw 50 mL bloed drie tot vijf dagen na de laatste injectie (zie stap 1.4) verzamelen.Opmerking: Snelle verwerking van bloed en isolatie van RNA is belangrijk voor het verkrijgen van een geschikt bibliotheek grootte15,3, dat is heel belangrijk voor het welslagen van de pannen. Verdun 15 mL van het verzamelde bloed met 5 mL PBS. Een lymfocyt scheiding buis om te isoleren van perifeer bloed lymfocyten (PBLs) door de kleurovergang centrifugeren dichtheid volgens fabrikanten suggesties gebruiken.Let op: Aanwijzingen van de fabrikant aangeven dat tot 25 mL bloed kunnen worden gebruikt, maar dit kan het systeem verzadigen en te voorkomen dat het verkrijgen van een schone lymfocyt voorbereiding. Voeg 5 mL PBS prechilled tot 4 ° C tot PGO. Spin gedurende 20 minuten bij 800 x g bij 4 ° C. Twee keer wassen door toevoeging van 5 mL PBS prechilled tot 4 ° C tot PGO gevolgd door het centrifugeren gedurende 20 minuten bij 800 x g bij 4 ° C. Isoleren totaal RNA met behulp van een draai-kolom gebaseerd systeem, volgens de instructies van de fabrikant. Meng de cellen door vertexing in passende buffer en toe te passen op een systeem van biopolymeer-Shredder. Gebruik een voldoende aantal mini- of maxi-kolommen op basis van de cel invoeren. CDNA met behulp van reverse-transcriptase door het combineren van 10 µg van RNA met een mix van 0,1 µg Oligo (dT) 12-18 inleidingen synthetiseren. Het genereren van een bacteriofaag-bibliotheek met behulp van gevestigde methoden4. Dit impliceert dat klonen met restrictie-enzymen in de bacteriofaag weergeven vector pMES4 gevolgd door de expressie van het donormateriaal gesmolten tot Gen III van de draadvormige bacteriofaag voor de productie van de bacteriofaag oplossing. 3. enkel domein antilichamen pannen Het produceren van antigeen affiniteit platen met behulp van oppervlakte behandelde 96-wells-platen. Verdun 0,25 µg van het antigeen in 100 mM natriumcarbonaat buffer, pH 9.0. Voeg 100 µL van deze oplossing aan elk putje en na een nacht bebroeden bij 4 ° C. Jas twee putten per antigeen. Bereid een blanco-controle goed dat is bedekt met carbonaat buffer alleen.Opmerking: Platen kunnen worden geproduceerd en opgeslagen voor tot een week bij 4 ° C als meerdere rondes van de selectie zal worden uitgevoerd. Ook, deze methode maakt gebruik van directe absorptie die geen labelen vereist terwijl andere methoden maken gebruik van biotinylation of andere soorten labeling van strategieën. Na de plaat een nacht bebroeden. Omkeren om te verwijderen van de inhoud van de putten en was driemaal met 0,1 mL PBS-T. Blokkeren de putten door toevoeging van 0,1 mL BSA (20 mg/mL) in PBS en de plaat gedurende 2 uur bij kamertemperatuur incuberen. Spoel de plaat driemaal met PBS-T gevolgd door driemaal met PBS. Antigenen kunnen ook worden covalent geëtiketteerd en gebruikt in opname systemen zoals, bijvoorbeeld, streptavidine/Biotine systemen. De faag-oplossing (100 µL) met 100 µL van 40 mg/mL BSA in PBS op een trillend platform bij kamertemperatuur gedurende 30 minuten vooraf te behandelen. De faag oplossing aan het antigeen gecoat wells en incubeer met zachte agitatie gedurende 2 uur op kamertemperatuur toevoegen. Gebruik meerdere putten met het oog op een totaal van 1011 bacteriofaag voor elk antigeen. De niet-afhankelijke faag negeren door inversie en vervolgens was de putjes goed vijfmaal met 200 µL van PBS-T gevolgd door vijf keer met PBS. Elueer de afhankelijke faag door toevoeging van 0,1 mL van 0,25 mg/mL trypsine in PBS en incubatie gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur op het trillende platform op 700 rpm. Breng de oplossing over in een flesje met 5 µL van 4 mg/mL 4-benzenesulfonyl fluoride hydrochloride(AEBSF) oplossing om quench trypsine activiteit. Groeien TG1 faag display bevoegde cellen bij 37 ° C met schudden tot OD600 = 0,5. 50 µL van geëlueerd bacteriofaag aan 3 mL van de TG1 cellen toevoegen. Incubeer bij 37 ° C zonder schudden voor 30 min. Voeg 7 mL van LB-media aangevuld met 100 µg/mL ampicilline, 2% glucose. Shake’s nachts bij 37 ° C.Opmerking: Voor het verkrijgen van de meest uiteenlopende enkel domein antilichamen, kunnen klonen worden sequenced getest voor gewenste eigenschappen en gebruikt na een ronde van de pannen. Voor het verkrijgen van de hoogste affiniteit enkel domein antilichamen, moeten twee rondes van de pannen worden benut. Plaat de bacteriën na overnachting groei op LB agar platen aangevuld met 100 µg/mL ampicilline, 2% glucose. Verscheidene seriële verdunningen worden getest, moet beginnen met twee verdunningen, plating 100 µL van 1/10.000 en 1/100.000 verdunningen. Incubeer de plaat ‘s nachts bij 37 ° C. Kies de kolonies en de putten van een steriele 96-wells-plaat met 100 µL van 2XYT met 100 µg/mL ampicilline, 2% glucose, 10% (v/v): glycerol per putje beënten. Na een nacht bebroeden bij 37 ° C zonder schudden. De volgende dag, schudden bij 170 t/min bij 37 ° C gedurende 60 minuten. Verwijder 2 µL van de media in PCR buizen. De resterende oplossing kan worden achtergelaten in de plaat en opgeslagen bij 4 ° C gedurende 1-2 dagen of bevroren en opgeslagen bij-80 ° C voor later gebruik. Uitvoeren van PCR reactie gebruikend inleidingen die geschikt is voor de vector gebruikt. Voor pMES4 zijn PCR screening van positieve klonen gebruikt inleidingen die flank van de meerdere klonen site CCTATTGCCTACGGCAGCCGCTGGATTGTTATTAC en GGTGGTGTGAGGAGACGGTGACCTG. Gebruik maken van fietsen passende voorwaarden voor de polymerase gebruikt, een onthardende temperatuur van 57 ° C en 30 cycli. Het analyseren van de PCR reactie met het runnen van een agarose gel van 1% (m/v). Kolonies die positief hebben enkel domein antilichamen gene inzetstukken van ~ 500 bp. Zorg ervoor dat de positieve klonen 20-50% van het monster zijn.Opmerking: Deze methode biedt een manier voor kloon selectie en analyse die kan worden uitgevoerd in de meeste onderzoekslaboratoria. Als alternatief, volgende-generatie sequentie kan worden toegepast en biedt grote datasets waarmee statistische en vergelijkende analyses16. Beënt de positieve klonen van de plaat in verse buizen met 7 mL LB met 100 µg/mL ampicilline. Groeien met schudden voor overnachting bij 37 ° C. Het uitvoeren van een miniprep op de cultuur te verkrijgen van de plasmide DNA. Volgnummer positieve klonen met behulp van de standaard rangschikking primer pEX-Rev (CAGGCTTTACACTTTATGCTTCCGGC). Computationele analyses uit te voeren op de resulterende enkel domein antilichamen sequenties. Ervoor zorgen dat er geen stop-codonen of frame verschuift. Classificeren de resulterende sequenties voor gelijkenis en diversiteit. De sequenties die zijn herhaaldelijk zijn waarschijnlijk hoge affiniteit binden sequenties, met name na de twee rondes van de selectie. Express van het antilichaam van de één domein met behulp van een expressie BL21 afkomstige stam van E. spoel. Induceren van de expressie door de toevoeging van IPTG, groeiende ‘s nachts bij 22 ° C. Het zuiveren van het antilichaam van de één domein met behulp van de geïmmobiliseerdet metal affiniteitchromatografie (IMAC). Valideren van één domein antilichaam/antigeen bindende met behulp van een directe interactie assay zoals pull-down, inheemse gelelektroforese of ELISA. Controleer of toepassingsspecifieke enkel domein antilichamen prestaties, desgewenst voor de specifieke experiment.