חיסונים של האלפקות (לאמה pacos) עם חלבונים אנטיגניים וייצור נוגדנים תחום יחיד אנטיגן ספציפי

כל ההליכים עם האלפקות בוצעו על פי פרוטוקולים (2017-2627 ו- 2018-2925) אושרה על ידי של אוניברסיטת קנטאקי אכפת לי חיה מוסדיים שימוש הוועדה (IACUC). 1. דור של אנטיגן ספציפי אלפקה נוגדנים טיפול אלפקה ושיקולים כללי להשיג אישור מוסדיים ו/או הרגולציה המתאימה. להשיג אלפקות למבוגרים, פחות מ- 10 שנים של גיל עם גוף במצב ציון של 3.0 לפחות (סולם 1-5)12. . כי הם עדר חיות, בית מינימום של שני אבל רצוי שלושה בעלי חיים ביחד.הערה: זכרים מומלץ כי, ככלל, הם יש טמפרמנט אפילו יותר קל יותר לעבוד עם. לבדוק את מצב הבריאות של חיות דרך בדיקה וטרינרית כולל הסקירה של דיאטה, דיור, חיסון, טפיל בקרת תוכניות13. ודא החיות מעודכן עם חיסונים המתאימים לאזור הגיאוגרפי המקומי המבוסס על המלצות וטרינרי מקצועי. לפתח טפיל חוץ – endoparasite בקרת תוכנית בהתייעצות עם רופא וטרינר בהתבסס על סקירה של ההיסטוריה של העדר של המקור ושל תנאים מקומיים מסוימים13. ואקלום של שבוע אחד לפחות, כולל הכשרה הלטר וחשיפה איפוק. לאסוף דגימת דם 4 מ”ל לקבל סרום לשימוש כפקד חיסון קדם (ראה צעד 1.4). להקפיא את סרה ולאחסן ב-20 ° C ב- 0.5 מ ל aliquots.הערה: בשלב זה, ניתן לקחת דם נוסף עבור ניתוח מלא ספירת דם (CBC) לעקוב אחר מצב תקינות הראשונית החיה. הכנה אנטיגן להכין חלבונים מטוהרים אנטיגניים תמיסת מלח באגירה פוספט (PBS) או תמיסת מלח באגירה HEPES (HBS) ותתרכזי כדי ≥1 מ”ג/מ”ל כ 3 מ ג חלבון נחוץ עבור פרוטוקול מלא, לרבות חיסונים, גלילה לצדדים, אישור של שיבוטים.הערה: גמליים נוגדנים מציגים ירידה לפרטים גבוה, סלקטיביות נגד חלבונים אנטיגניים אך לא מתאימים בדרך כלל חלבונים לא מובנים או אנטיגנים פפטיד אשר הם בדרך כלל לא מובנים. להקים טוהר אנטיגן, עם טוהר > 90% הרצוי. לנצל שיטה אנליטית כגון עמודים מרחביות.התראה: זיהום משמעותי עם חלבונים אחרים יכול להוביל לבעיות במהלך הבחירה היכן נוגדנים מחשבים בודדת ניתן לבודד מזהמים מאשר את חלבון המטרה. להכין aliquots הקפוא של אנטיגן המכילה סכום כולל של 100 µg של אנטיגן. µL 50 של 2 מ”ג/מ”ל הכנה אידיאלית. µL 100 של 1 מ”ג/מ”ל הוא הפתרון חלבון שתדללו הכי מתאים חיסונים. לחלופין, אם לא ניתן לעבור ההקפאה/ההפשרה אנטיגן ידוע להיות יציב פתרון לטווח ארוך, ניתן לאחסן ב 4 º C.הערה: כדי להבטיח שאנטיגן יכולות לעבור מחזור ההקפאה/ההפשרה, בדיקה ש-aliquot 20 µL של אנטיגן צריך ובשמפו לתוך דקה עם קירות PCR צינור והצמדה קפוא חנקן נוזלי. להפשיר את הצינור, לבצע במהירות גבוהה צנטריפוגה ולוודא את ההתאוששות כמותיים על-ידי השוואת UV/VIS הקליטה לפני ואחרי הקפאה או על-ידי הפעלת של ג’ל מרחביות-דף. אם אפשרי, צריך אנטיגן גם להיבדק על השמירה של פעילות ביולוגית. אם מחזור הפשרת ההקפאה הוא מוצלח, אנטיגן הנותרים הוא הצמד קפוא 100 µL aliquots ומאוחסנים ב-80 מעלות צלזיוס. אם יש בעיות עם מחזור ההקפאה/ההפשרה, הפרוטוקול יכול לחזור עם התוספת של עד 20% גליצרול. התחסנות לערבב עד חמישה אנטיגנים, 200 µg כל אחד, עם אדג’וונט באמצעי אחסון הסופי של בין 300 עד 1,000 µL. אדג’וונט יהוו ≥50% נפח סופי השימוש במים diluent.הערה: אם המאגר אינו הכרחי, להשתמש HEPES, מגבים או גליצין. PH בין 5 ו- 6 הוכיח לעיתים קרובות להיות יותר נוח מאשר נייטרלית לחלוטין. הימנע יונים ערכיות כגון פוספט או ציטראט, מאחר שהם יכולים לעורר קרישת הדם. קיצוץ השיער של האלפקה. עם מספריים חשמליות, בדפוס חרמש הירח לאורך הבסיס של הצוואר של כתף לכתף כדי לחשוף את האזורים הסמוכים אל בלוטות הלימפה קשת. מחזיק האלפקה בצוואר, לאט מזריקים אנטיגן subcutaneously לאורך הבסיס של הצוואר ליד בלוטות הלימפה קשת באמצעות מחט 22 גרם. לבצע חמש זריקות של µL ~ 200 (או פחות) ~ 5 ס מ אחד מהשני.הערה: החיות צריך ריסון על ידי חבר סגל השנייה במהלך הזריקות. הזרקת ודימום אלפקות דורש זהירות מכיוון שהן נוטה בועט, לא רק מאחור אבל לצדדים. שיש חיות זה לזה, קבוצה, במהלך ההליכים הוא אופטימלי. בהתחשב בכך, הם חיות עדר הם רגועים יותר בקבוצה, איפוק המשוייכת נדרש במהלך ההליכים. לפקח על החיות להזרקה ~ 20 דקות פוסט סימנים של אנפילקסיס (ראה צעד 1.6). צג עבור דלקת מקומית באתרי הזרקה שבועי, אשר לא צפוי בעת שימוש את אדג’וונט המומלצת. ודא כי דליפת דם מהאתר של הזרקת אינה מוגזמת. לבצע חמש זריקות עוקבות boosting שבועי באמצעות 100 µg של כל אנטיגן ומערבבים. מסיכה לשיער באתרי הזרקה עשוי להידרש אחת לשבוע בהתאם לעונה. בסתיו ובחורף, השיער החיות יכול לצמוח במהירות. עד זוב דם קליפ ולחטא אתר אוסף עם מטליות אלכוהול. לרסן את החיה בעדינות עם הצוואר מוחזק זקוף, ישר.הערה: בעלי חיים יכול לרסנם באופן ידני כפי שמתואר בסרטון. אם הוא זמין, שימוש המצנח אלפקה לרסן את האלפקות במהלך הדימום, זריקות יכולה להקל על הטיפול. לשימוש של המצנח אלפקה, אלפקות haltered הוביל לתוך תעלת, משחרר את רצועות עם מהדורות מהיר וברים של הצוואר. גירסאות של המגלש אלפקה זמינות של ספקים מסחריים. באמצעות ההקרנה הגחון של התהליך רוחבי של החוליות כנקודת ציון, occlude את הווריד על ידי הפעלת לחץ פשוט המדיאלי לתהליך הגחון.הערה: יש פארו צוואר ברורים אין אלפקה למבוגרים. העורקים העורק מוגנים על-ידי הקרנות הגחון של התהליכים בחוליות רוחבי. זה עור עבה (למשל, 1 ס מ עבה “נלחמים צלחת” 1/3 האמצעי של צוואר אצל זכרים) מערכת השרירים בצוואר ומקשה באופן חזותי או ימשש ומוחלף על עצמו. כתוצאה מכך, השימוש ציוני בחוליות הוא האינדיקטורים מועיל ביותר עבור מיקום צוואר. הכנס את המחט בזווית של 45° מעט המדיאלי (~ אצבע רוחב) כדי ההקרנה לעבר המרכז של הצוואר. לתפעל את המחט עד זרימת הדם.הערה: עורק הצוואר ואת העורק קרובים אחד לשני. דם ורידי יכול להיות די בצבע אדום אבל עדיין כהה יותר מדם עורקי. מסע בעקבות, הלחץ צריך להיות מוחל על האתר של 0.5-1 דקות (או יותר אם בעורק מתבצעת) עד hemostasis מובטחת. לצייר 4-10 מ”ל של דם למטרות אנליטית. לנצל את a 1.5 inch, המחט 20 גרם בדרך כלל בשילוב עם מזרק בגודל המתאים או דם אוסף שפופרת. לנצל לבנדר העליון K2צינורות EDTA לאיסוף הדם כולו כאשר לטיהור לימפוציטים. לנצל זהב סרום העליון ההפרדה צינורות (BD) בעת איסוף הדם לייצור סרום. צייר 50-100 מ של דם למטרות ייצור. השתמש הרחבה נוספים 12 אינץ אינפוזיה סט עם ערכת אינפוזיה 19-20 G המכונף “פרפר”.הערה: סיומת להגדיר תצורה מאפשרת עוזר למלא מספר צינורות איסוף דם, ומאפשר את venipuncturist להתמקד ייצוב המחט אוסף. התוספת של ערכת אינפוזיה להכיל פוטנציאל התנועה של החיה (3-5 דקות הליך) ונותן במרחק נוח לעבוד עבור המפעילים. החיסון ניטור שלושה-ארבעה ימים לאחר את 3rd ו-th 5 זריקות, לבצע בליד מבחן קטן מתוך כל בעל חיים כדי להשיג סרה לבדיקה. הקפאת ולאחסן את sera ב- 0.5 מ ל aliquots. להשיג דגימות דם נוספות באותו זמן מעקב של החיה, כפי שפורט לעיל. לאשר הנוכחות של נוגדנים אנטיגן ספציפי על-ידי אליסה באמצעות של sera המתקבל במבחן דימומים בנקודות זמן מראש מערכת החיסון שלושה שבועות, חמישה שבועות. עדיף לקחת דימום הסופי ואילו כייל נוגדנים עדיין עולה. לייצר אנטיגן זיקה צלחות באמצעות משטח הלוחיות 96-ובכן שטופלו. לדלל 0.1 µg של אנטיגן במאגר סודיום קרבונט 100 מ מ, pH 9.0. להוסיף 100 µL של הפתרון מכל קידוח, דגירה בין לילה ב 4 º C. דילולים עשר של כל אנטיגן נבדקים כפילויות. פקד ריק טוב מוכן זה מצופה קרבונט מאגר בלבד. לאחר לילה הדגירה, להפוך את הצלחת להסיר את התוכן של הבארות. ולשטוף שלוש פעמים עם 0.1 מ”ל ל- PBS, 0.1% Tween 20 (PBS-T). לחסום את הבארות על-ידי הוספת מ 0.1 ל BSA (5 מ”ג/מ”ל) ב- PBS-T המקננת את הצלחת לשעה בטמפרטורת החדר. לשטוף את הצלחת שלוש פעמים עם PBS-T מאת pipetting הפתרון שטיפת לתוך הבאר ולאחר מכן להסיר את הפתרון שטיפת מאת ההיפוך של הצלחת. להכין דילולים טורי כפולה של 0.3 מ ל כל אחד סרה מראש המערכת החיסונית ואת המערכת החיסונית במאגר PBS-T באמצעות לדילול ההתחלתי של 1/100, עד 1/102, 400. להוסיף 100 µL של דילול כל הבארות, מאפשרים תקופת דגירה של 2 h בטמפרטורת החדר. הסר את הנסיוב מכל קידוח, לשטוף עם 0.2 מ של PBS-T שלוש פעמים. דגירה אחד טוב עם 0.1 מ”ל של עז מצומדת HRP לאמה אנטי איג נוגדנים לדילול 1:20,000 לשעה.הערה: התגובה החיסונית נמדד כולל שניהם קונבנציונליות כמו גם נוגדנים רק שרשרת כבדה, אשר נמצאים ביחס שווה כ מחזור3,14. להסיר את הפתרון נוגדן. ולשטוף את כל טוב עם 0.2 מ של PBS-T שלוש פעמים. להוסיף 100 µL של מצע peroxidase הדפסות כסף אל הבאר, דגירה בטמפרטורת החדר עד האינטנסיביות של שתי הנקודות הריכוז הגבוה ביותר חייב להיות רווי, אשר בדרך כלל לוקח 5-10 דקות. להוסיף 100 µL של חומצה גופרתית 0.1 M בכל טוב כדי לעצור את התגובה. למדוד את ספיגת כל הבאר-450 nm שימוש בקורא צלחת. להתוות את ספיגת כמו ריכוז פונקציה. סיבוכים ניטור ופוטנציאליים אלפקה ודא אלפקה המתאים ניטור לאורך כל ההליך.הערה: ההליכים אינן צפויות לגרום תופעות לוואי משמעותיות. בעלי חיים רווחה ובריאות צריך לפקח מדי יום על ידי אנשי האחזקה ו/או מחקר במהלך האכלת והשקיית. כל חיה עם תחלואה טבעית unalleviated המושרה בניסוי, או ספונטנית חייב להתייחס על ההערכה על-ידי השירותים הוטרינריים עם treatment(s) מסופקים לפי הצורך, עד ההומני, במידת הצורך.השלכות אפשריות המשויך דם ורידי הם דימום, נקיפה, שטף דם. בעלי החיים צריך לפקח על לקיחת הדם פוסט 20 דקות לחפש הסימנים של דימום. הלחץ הנוסף באתרים אמור לשמש. אם הדימום לא מפסיק, וטרינר צריך ליצור קשר.ההשלכות שלילית פוטנציאליים אחרים הקשורים זריקות ודימום כוללים גרנולומה היווצרות דלקת. היווצרות גרנולומה לא צפויה, לא נצפתה ב אוניברסיטת קנטאקי. דלקת באתר ההזרקה (אדמומיות או נפיחות) יכול להתרחש, צריך להביא את תשומת הלב של וטרינר. הגלישה הייצור מייצג נפח משמעותי פוטנציאלי של הדם, בעלי החיים צריך לפקח על מנת להבטיח כי הם יציבים ופעיל לאחר איסוף דם.אנפילקסיס ותגובות פירוגני הם שני ככל הנראה שלילית התוצאות החמורות, אך הם נצפו לעתים רחוקות מאוד. אם זה היה להתרחש, אנפילקסיס להתרחש זמן קצר לאחר זריקות אנטיגן, לידי עלייה טמפרטורה רקטלית, חולשה, הקאות, בעיות נשימה, ו/או שלשולים. טמפרטורה רקטלית יכולה להיות במעקב אחרי כל זריקה כדי לזהות כל עלייה בטמפרטורת הגוף. אם אלו מזוהים להודיע וטרינר מיד ליעוץ. בנוסף, “קראש ערכת חירום” (למשל, אפינפרין, סטרואידים ותרופות אנטי היסטמין) מוכן תוך התייעצות עם רופא וטרינר צריך להיות זמין לטיפול החשודים יש תגובה נגדית. 2. מטהר את לימפוציטים לבנייה ספריית נוגדן מחשבים בודדת לאסוף 50 מ של דם שלושה עד חמישה ימים לאחר הזריקה האחרונה (ראה צעד 1.4).הערה: עיבוד מהיר של דם ובידוד של RNA חשוב להשיג ספרייה מתאים בגודל15,3, אשר חשוב מאוד להצלחת panning. לדלל 15 מ”ל של הדם שנאספו עם 5 מ של PBS. לנצל את צינור ההפרדה לימפוציט לבודד דם היקפיים לימפוציטים (PBLs) על ידי צפיפות צנטריפוגה מעבר צבע על פי הצעות נוספות ואיכותיות.התראה: הוראות היצרן מציינים כי ניתן להשתמש עד 25 מ של דם, אבל זה ייתכן להרוות את המערכת ולמנוע בקבלת תכשיר לימפוציט נקי. הוסף 5 מ של PBS prechilled עד 4 ° C כדי למידה. ספין כעשרים דקות ב x 800 גרם ב 4 º C. לשטוף פעמיים על-ידי הוספת 5 מ של PBS prechilled עד 4 ° C כדי למידה ואחריו את צנטריפוגה כעשרים דקות ב x 800 גרם ב 4 º C. בודד הכולל RNA באמצעות מערכת ספין עמודות בהתבסס, על פי הוראות היצרן. Homogenize התאים מאת vertexing מאגר המתאים, החלה על מערכת ביופולימרים-גיזום. השתמש מספר מתאים של מיני או מקסי-עמודות בהתאם לתא קלט. לסנתז cDNA באמצעות רוורס טרנסקריפטאז על ידי שילוב של µg 10 של RNA עם שילוב של 0.1 µg של Oligo (dT) תחל 12-18. צור ספריה bacteriophage באמצעות שיטות הוקמה4. פעולה זו כרוכה שיבוט עם אנזימי הגבלה לתוך pMES4 וקטור התצוגה phage ולאחריו הביטוי של הקדמי התמזגו עם ג ‘ ין השלישי phage filamentous לייצור של הפתרון phage. 3. תחום יחיד נוגדן פאנינג לייצר אנטיגן זיקה צלחות באמצעות משטח הלוחיות 96-ובכן שטופלו. לדלל µg 0.25 של אנטיגן במאגר סודיום קרבונט 100 מ מ, pH 9.0. להוסיף 100 µL של פתרון זה מכל קידוח, דגירה בין לילה ב 4 º C. מעיל שתי בארות לכל אנטיגן. להכין ריק פקד טוב מצופה קרבונט מאגר בלבד.הערה: צלחות יכול להיות מיוצר ומאוחסן לשבוע עד אחד ב 4 ° C אם יבוצעו מספר סיבובים של בחירה. בנוסף, שיטה זו משתמשת במסלול הקליטה הישירה, אשר אינה דורשת תיוג בעוד שיטות אחרות להשתמש biotinylation או סוגים אחרים של תיוג אסטרטגיות. דגירה בן לילה את הצלחת. היפוך להסיר את התוכן של הבארות. ולשטוף שלוש פעמים עם 0.1 מ”ל של PBS-טי לחסום את הבארות על-ידי הוספת מ 0.1 ל BSA (20 מ”ג/מ”ל) ב- PBS המקננת את הצלחת. בשביל 2 h בטמפרטורת החדר. לשטוף את הצלחת שלוש פעמים עם PBS-T ולאחריו שלוש פעמים עם PBS. אנטיגנים יכולים גם להיות covalently מתויג, שבשימוש במערכות לכידת כמו, לדוגמה, streptavidin/ביוטין מערכות. מראש פנקו הפתרון phage (100 µL) עם 100 µL של 40 מ”ג/מ”ל BSA ב- PBS על פלטפורמה רוטטת בטמפרטורת החדר למשך 30 דקות. הוסף הפתרון phage אנטיגן מצופה בארות דגירה עם עצבנות עדין עבור 2 h בטמפרטורת החדר. השתמש בארות מרובים על מנת להבטיח סך של 1011 phage עבור כל אנטיגן. למחוק את phage לא מאוגד על-ידי היפוך ולאחר מכן לשטוף הבארות חמש פעמים עם 200 µL של PBS-T ולאחריו חמש פעמים עם PBS. Elute את phage המאוגד על-ידי הוספת 0.1 מ”ל של 0.25 מ”ג/מ”ל טריפסין PBS ו המקננת למשך 30 דקות בטמפרטורת החדר על פלטפורמת רוטטת-700 סל ד. להעביר את הפתרון בקבוקון המכיל 5 µL של 4 מ”ג/מ”ל 4-benzenesulfonyl פלואוריד hydrochloride(AEBSF) פתרון כדי להרוות טריפסין פעילות. לגדול TG1 phage התצוגה תאים המוסמכת ב 37 ° C עם לרעוד עד OD600 = 0.5. להוסיף 50 µL של eluted phage 3 מ”ל של תאי TG1. דגירה ב 37 ° C ללא רועד למשך 30 דקות. להוסיף 7 מ ל LB מדיה בתוספת 100 µg/mL אמפיצילין, 2% גלוקוז. לנער בן לילה ב 37 º C.הערה: כדי להשיג את הנוגדנים מחשבים בודדת מגוונת ביותר, שיבוטים יכול להיות וסודרו, נבדק עבור המאפיינים הרצויים, מנוצל אחרי סיבוב אחד של גלילה רציפה. כדי להשיג הזיקה הגבוהה נוגדנים מחשבים בודדת, שני סיבובים של גלילה רציפה צריך להיות מנוצל. צלחת החיידקים לאחר גידול לילה על פלטות אגר LB בתוספת 100 µg/mL אמפיצילין, 2% גלוקוז. מספר סידורי דילולים תצטרך להיבדק, מתחיל עם שני דילולים, ציפוי µL 100 של 1/10,000 ו- 1/100,000 דילולים. דגירה את הצלחת בן לילה ב 37 º C. לבחור את המושבות, לחסן הבארות של צלחת 96-ובכן סטרילי המכיל 100 µL של 2XYT עם 100 אמפיצילין µg/mL, 2% גלוקוז 10% v/v גליצרול לכל טוב. דגירה בין לילה ב 37 ° C ללא רועד. למחרת, לנער-170 סל ד ב 37 מעלות צלזיוס למשך 60 דקות. הסר את 2 µL של המדיה לתוך המבחנות. הפתרון הנותרים יכולים להיות השאירה בצלחת המאוחסנים ב 4 מעלות צלזיוס למשך 1-2 ימים או קפוא ו המאוחסן ב- 80 ° C לשימוש מאוחר יותר. לבצע PCR תגובה באמצעות תחל מתאים וקטור מנוצל. עבור pMES4, PCR הקרנת הסרט תחל שימושים חיוביים שיבוטים מחזיתות האתר שיבוט מרובים הם CCTATTGCCTACGGCAGCCGCTGGATTGTTATTAC ו GGTGGTGTGAGGAGACGGTGACCTG. לנצל את תנאי הרכיבה המתאים עבור פולימראז בשימוש, של הטמפרטורה מחזק של 57 ° C, ו 30 מחזורים. לנתח את תגובת ה-PCR על-ידי הפעלת ג’ל agarose 1% (w/v). מושבות הם חיוביים יש מחשבים בודדת נוגדן ג’ין מוסיף ~ 500 bp. ודא כי חיובי שיבוטים הם 20-50% מכלל המדגם.הערה: שיטה זו מספקת אמצעי שיבוט בחירה וניתוח שניתן לבצע במעבדות מחקר רוב. לחלופין, הדור הבא רצפי יכול להיות מיושם ומספק אלגוריתמית המאפשרים סטטיסטי וניתוח השוואתי16. לחסן את השיכפולים חיובי מהצלחת לתוך צינורות טריים המכיל 7 מ ל LB עם 100 אמפיצילין µg/mL. לגדול עם טלטול נלון ב 37 º C. לבצע miniprep של התרבות להשיג DNA פלסמיד. רצף חיובי שיבוטים שימוש בתקן רצף פריימר pEX-Rev (CAGGCTTTACACTTTATGCTTCCGGC). לבצע ניתוח חישובית ברצפי נוגדן מחשבים בודדת המתקבלת. ודא כי יש codons אין עצירה או מסגרת משמרות. לסווג את רצפי וכתוצאה מכך דמיון והמגוון. הרצפים המזוהים שוב ושוב סביר להיות זיקה גבוהה מחייב רצפים, במיוחד לאחר שני סיבובים של בחירה. אקספרס הנוגדן מחשבים בודדת באמצעות זן הביטוי נגזר BL21 של הגליל א. זירוז הביטוי באמצעות התוספת של IPTG, גדל בן לילה-22 מעלות צלזיוס. לטהר הנוגדן מחשבים בודדת באמצעות קיבוע המתכת כרומטוגרפיית זיקה (IMAC). אמת כריכת אנטיגן נוגדן/מחשבים בודדת וזמינותו האינטראקציה הישירה כגון נפתחים, יליד בג’ל או אליסה. ודא ביצועים נוגדן ספציפי ליישום מחשבים בודדת, כרצונכם לניסוי מסוים.