تحصين الألبكة (باكوس لاما) مع المستضدات البروتين وإنتاج محددة مستضد "واحد المجال الأجسام المضادة"
Summary
بما في ذلك التحصين وجمع الدم وعزل خلايا ب والتحديد أسلوب لإنتاج الأجسام المضادة لمجال واحد من الألبكة، وصف.
Abstract
في هذه المخطوطة، وصف طريقة لتحصين الألبكة واستخدام طرق البيولوجيا الجزيئية لإنتاج أجسام مضادة محددة مستضد مجال مفرد وأظهر. الإبليات، مثل الألبكة واللاما، أصبحت مصدرا قيماً للبحوث الطبية الحيوية نظراً لأنها تنتج نوع جديد من جسم السلسلة فقط الثقيلة التي يمكن استخدامها لإنتاج أجسام مضادة مجال مفرد. نظراً لأن الجهاز المناعي درجة عالية من المرونة، مجال مفرد الأجسام المضادة يمكن جعل العديد من المستضدات البروتين المختلفة، ووالتشكلات المختلفة حتى للمستضد، بدرجة عالية جداً من الدقة. هذه الميزات، بين أمور أخرى، جعل مجال مفرد الأجسام المضادة أداة لا تقدر بثمن للبحوث الطبية الحيوية. وتفيد التقارير وسيلة لإنتاج الأجسام المضادة لمجال واحد من الألبكة. ويرد وصف بروتوكول للتحصين وجمع الدم وعزل الخلية ب. ب-الخلايا تستخدم لبناء مكتبة تحصينا، الذي يستخدم في اختيار مجال واحد معين الأجسام المضادة عن طريق الغسل. مجال واحد محدد المفترضة الأجسام المضادة التي تم الحصول عليها عن طريق الغسل تؤكدها سحب لأسفل، أليسا، أو فحوصات هلام-التحول. ثم يمكن استخدام الأجسام المضادة الناتجة عن مجال واحد أما مباشرة أو كجزء من كاشف هندسيا. وتشمل الاستخدامات جسم مجال واحد ومجال واحد على أساس جسم الحكام التطبيقات الهيكلية والبيوكيميائية والخلوية، والحية في والعلاجية. الأجسام المضادة لمجال واحد يمكن أن تنتج بكميات كبيرة كما البروتينات المؤتلف في نظم التعبير بدائية، وتنقيتها، واستخدامها مباشرة أو يمكن إجراء هندسة عكسية لتحتوي على علامات محددة أو العلامات التي يمكن استخدامها كالصحفيين في الدراسات الخلوية أو في التشخيص.
Introduction
الألبكة، وأعضاء آخرين من الأسرة الكامليد، وأصبحت مصدر شعبية لتوليد الأجسام المضادة لبحوث الطب الأحيائي1،،من23. وقد الإبليات نظام المناعة فريدة من نوعها حيث أنها تنتج الأجسام المضادة العادية فضلا عن الأجسام المضادة الوحيدة السلسلة الثقيلة التي تسمح بإنتاج أصغر بكثير من الأجسام المضادة مجال مفرد، مع الاحتفاظ بخصوصية عالية وعالية تقارب. وبالتالي، توفر الأجسام المضادة الكامليد كاشف تنوعاً مفيدة لمجموعة متنوعة من الأغراض. ويرد هنا طريقة لتحصين الألبكة وإنتاج أجسام مضادة في مجال واحد لمجموعة متنوعة من المستضدات البروتين. يمكن أن تنتج هذه الأجسام المضادة في الإبليات عبر عملية معقدة نسبيا فقط يتطلب التحصين عن طريق الحقن الصغيرة من البروتين المستهدف (antigen) و رسم دم4. بعد ذلك، يستخدم بناء مكتبة، M13 بالعاثية العرض5 والغسل مقابل مستضد المؤتلف6 لعزل وإنتاج أجسام مضادة مجال واحد مع الخصائص المرغوبة. نظراً لأن العملية يستفيد من قوة بالعاثية عرض التكنولوجيا، المستضدات خمسة أو أكثر يمكن أن تستخدم في وقت واحد للحيوان الواحد، مما يقلل من عدد الحيوانات المستخدمة والتكاليف المرتبطة بها.
أضداد الثدييات النموذجية أو المناعية هي جزيئات كبيرة تتكون من نوعين من سلاسل (2 سلاسل ثقيلة وسلاسل خفيفة 2)، التي ترتبط معا من خلال سندات ثنائي كبريتيد. هذه الأجسام المضادة كبيرة نسبيا، نستعرض الأوزان الجزيئية ~ 140-190 كاتشين للأنواع مفتش أكثر وفرة من البشر والفئران، والماعز والأرانب. بسبب هيكلها وحدة فرعية متعددة وعالية الوزن الجزيئي، وسندات ثنائي كبريتيد، يمكن المناعية الصعبة بدلاً من تنتج بكميات كبيرة، مما يجعل كلفتها عالية. في تسعينيات القرن العشرين، وقد اتضح أن تجعل الإبليات، الذي يشمل الإبل واللاما والالبكه، بالإضافة إلى نوع الثدييات النموذجية الغلوبولين المناعي، شكل جديد من الغلوبولين المناعي أن أبسط في الهيكل، تمتلك سلاسل ثقيلة فقط7. هذه الأجسام المضادة الكامليد فريدة تمتلك نفس القدرة على ربط المؤثرات الخارجية مع تقارب عالية على وجه التحديد ولكن تتكون فقط من البروتين من سلسلة8. علاوة على ذلك، يمكن أن يتم اقتطاعها الأجسام المضادة الكامليد تجريبيا إلى جزء بلغة وحدة ححالخامس حتى أصغر، تسمى أيضا جسم مجال واحد9. نظراً لصغر حجمها، مجال مفرد الأجسام المضادة هي مفيدة لمجموعة واسعة من تطبيقات البحوث الطبية الحيوية والمتاحة من مجموعة متنوعة من المصادر الأكاديمية والتجارية1،10. يبدو استثناء إلى النشاف غربي منذ أكثر في كثير من الأحيان مجال مفرد الأجسام المضادة الموجهة ضد تكيف تعتمد [ابيتوبس]، التي تضيع عادة ظروف يشوه المستخدمة في البقع الغربية.
حيث أنها تتكون من سلسلة ببتيد واحد، يمكن تحديد مجال واحد معين الأجسام المضادة وسهولة إنتاجها بكميات كبيرة المؤتلف البروتينات في البكتيريا. مجال مفرد الأجسام المضادة يمكن أيضا أن يكون وراثيا تحتوي على علامات محددة أو العلامات التي يمكن استخدامها ك “مجموعات مراسل” لتشخيص الأمراض11. يجعل هذا سهولة التلاعب مقرونا مرونة استخدام الأجسام المضادة مجال مفرد موردا هاما للباحثين في الجامعات وفي أماكن أخرى.
كما دعم جزء من “المعاهد الوطنية للصحة” الأساسية، جرى تكييف لإنتاج الأجسام المضادة لمجال واحد من الألبكة3،4الأساليب القائمة. الألبكة بمزايا كبيرة في كلا سهولة التعامل بالنسبة إلى أكبر أفراد الأسرة الكامليد، فضلا عن إمكانية الوصول. الألبكة مطروحة على نطاق واسع للحوم والألياف، وهكذا يمكن الحصول على الصعيد الإقليمي من الباكا المحلية المزارعين، الذين يمكن التعرف من خلال مواقعها على شبكة الإنترنت أو من خلال جمعيات مربي الدولة. تتوفر اثنين من سلالات الألبكة، سوري وهواكايا. هواكايا هي أكثر شيوعاً، وقد استخدمت لهذا البروتوكول، ولكن البروتوكول المنطبقة عموما أما سلالات وتنطبق أيضا على نطاق أوسع إلى أخرى الإبليات.
Protocol
Representative Results
Discussion
كما لوحظ، تقارب عالية وخصوصية من الأجسام المضادة في مجال واحد، جنبا إلى جنب مع التعبير السطحية والاستقرار، الكواشف مثالية للتطبيقات في مجال البحوث الطبية الحيوية، ما يجعلها الكواشف الكيميائية الحيوية الحرجة، أدوات التشخيص، أو 18من العوامل العلاجية. للتطبيقات التجارية، وهناك بعض القضايا ذات الصلة بالفكرية الملكية التي يجب النظر فيها. بالإضافة إلى ذلك، يمكن إجراء هندسة عكسية الأجسام المضادة لمجال واحد تحتوي على علامات محددة أو العلامات التي يمكن استخدامها كالصحفيين في فحوصات الخلوية أو في التشخيص. المفتاح لهذه الاستخدامات هو القدرة على إنتاج أجسام مضادة في مجال واحد محدد ضد المستضدات للفائدة. أسلوب يتم وصف هنا إنتاج أجسام مضادة مجال مفرد باستخدام الألبكة، التي تنتج من استجابة مناعية قوية ضد طائفة واسعة من المستضدات البروتين. ويرد وصف الاعتبارات المتعلقة بالتعامل مع الحيوان، والامتثال للوائح التنظيمية. هذه هي المفتاح للنجاح في هذا الجزء من العملية.
وهناك استراتيجيات أخرى لإنتاج أجسام مضادة مجال واحد التي لا تتطلب خدمات التطعيم، ولكن بدلاً من ذلك استخدام مكتبات سيميسينثيتيك مع أنظمة مختلفة لاختيار والتحسين متكررة من الانتماءات19،20 . ومع ذلك، ميزة استخدام مكتبات المستمدة من الحيوانات المحصنين هو القدرة على موثوق عزل الأجسام المضادة عالية التخصيب المتنوعة والنسب العالية من مجال واحد. بالإضافة إلى ذلك، ليس فقط مراعاة الاختلافات تسلسل كبيرة، ولكن أغلبية كبيرة من الأجسام المضادة المجال واحدة محددة معزولة كان فريد عمليات الإدراج وعمليات الحذف، لا سيما في CDR3.
المجال علاوة على ذلك، واحد يمكن أن تنتج الأجسام المضادة عن طريق عملية مباشرة فقط ويتطلب الحقن الصغيرة للمستضد، وبعد هذه العملية، يمكن إرجاع الحيوانات إلى القطيع. ملاحظة، الحيوان يمكن استخدامها بحرية لإنتاج الألياف، ولكن يجب أن تستبعد من الاستخدام كاللحوم (السلسلة الغذائية البشرية) نظراً لاستخدام اختبار مولدات المضادات و adjuvant غير إدارة الأغذية والعقاقير المعتمدة لإنتاج الأجسام المضادة في مجال واحد. عند الانتهاء من الإجراء، الحيوانات ينبغي أن يرصد لمدة أسبوع واحد، نظراً لامتحان نهائي بيطرية، وثم يمكن أما عادوا إلى مزارعهم الرئيسية أو على راحة لمدة ستة أشهر قبل إجراء جولة أخرى من مجال واحد جسم إنتاج.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
وأيد هذا العمل “المعاهد الوطنية للصحة” (P30GM103486).
Materials
| GERBU FAMA adjuvant | Biotechnik, Heidelberg, Germany | 3003,6001 | |
| Serum collection tube | Becton Dickinson | 367983 | |
| Blood collection tube | Becton Dickinson | 366643 | |
| Vacutainer blood collection set | Becton Dickinson | 368652 | |
| Maxisorp Immuno plates | Nunc | 439454 | |
| BSA | Sigma-Aldrich | A7906 | |
| HRP-conjugated goat anti-llama IgG antibody | Bethyl Labs | A160-100P | |
| TMB reagent chromogenic peroxidase substrate | KPL | 50-76-03 | |
| Plate Reader | Spectramax | M5 | Any UV/VIS capable reader is acceptable |
| Uni-SepMAXI+ lyphocyte separation tube | Novamed | U-17 | |
| RNeasy Mini Kit | Qiagen | 74104 | |
| QIAshredder column | Qiagen | 79654 | |
| Superscript IV reverse transcriptase | Invitrogen | 18064014 | |
| AEBSF solution | Biosynth | A-5440 | |
| TG1 phage display competent cells | Lucigen | 60502 |
References
- Krah, S., et al. Single-domain antibodies for biomedical applications. Immunopharmacology and Immunotoxicology. 38 (1), 21-28 (2016).
- Rothbauer, U., et al. Targeting and tracing antigens in live cells with fluorescent nanobodies. Nature Methods. 3 (11), 887-889 (2006).
- Maass, D. R., Sepulveda, J., Pernthaner, A., Shoemaker, C. B. Alpaca (Lama pacos) as a convenient source of recombinant camelid heavy chain antibodies (VHHs). Journal of Immunological Methods. 324 (1-2), 13-25 (2007).
- Pardon, E., et al. A general protocol for the generation of Nanobodies for structural biology. Nature Protocols. 9 (3), 674-693 (2014).
- Hertveldt, K., Belien, T., Volckaert, G. General M13 phage display: M13 phage display in identification and characterization of protein-protein interactions. Methods in Molecular Biology. 502, 321-339 (2009).
- Kushwaha, R., Schafermeyer, K. R., Downie, A. B. A protocol for phage display and affinity selection using recombinant protein baits. Journal of Visualized Experiments. (84), e50685 (2014).
- Hamers-Casterman, C., et al. Naturally occurring antibodies devoid of light chains. Nature. 363 (6428), 446-448 (1993).
- Muyldermans, S., et al. Camelid immunoglobulins and nanobody technology. Veterinary Immunology and Immunopathology. 128 (1-3), 178-183 (2009).
- Muyldermans, S. Nanobodies: natural single-domain antibodies. Annu Rev Biochem. 82, 775-797 (2013).
- Muyldermans, S., Cambillau, C., Wyns, L. Recognition of antigens by single-domain antibody fragments: the superfluous luxury of paired domains. Trends in Biochemical Sciences. 26 (4), 230-235 (2001).
- Wang, Y., et al. Nanobody-derived nanobiotechnology tool kits for diverse biomedical and biotechnology applications. International Journal of Nanomedicine. 11, 3287-3303 (2016).
- Van Saun, R. J. Nutritional requirements and assessing nutritional status in camelids. Veterinary Clinics of North America: Food Animal Practice. 25 (2), 265-279 (2009).
- Jones, M., Boileau, M. Camelid herd health. Veterinary Clinics of North America: Food Animal Practice. 25 (2), 239-263 (2009).
- Daley, L. P., Gagliardo, L. F., Duffy, M. S., Smith, M. C., Appleton, J. A. Application of monoclonal antibodies in functional and comparative investigations of heavy-chain immunoglobulins in new world camelids. Clinical and Diagnostic Laboratory Immunology. 12 (3), 380-386 (2005).
- Romao, E., et al. Identification of Useful Nanobodies by Phage Display of Immune Single Domain Libraries Derived from Camelid Heavy Chain Antibodies. Current Pharmaceutical Design. 22 (43), 6500-6518 (2016).
- Henry, K. A., et al. Isolation of TGF-beta-neutralizing single-domain antibodies of predetermined epitope specificity using next-generation DNA sequencing. Protein Engineering, Design and Selection. 29 (10), 439-443 (2016).
- Burg, J. S., et al. Structural biology. Structural basis for chemokine recognition and activation of a viral G protein-coupled receptor. Science. 347 (6226), 1113-1117 (2015).
- Wesolowski, J., et al. Single domain antibodies: promising experimental and therapeutic tools in infection and immunity. Medical Microbiology and Immunology. 198 (3), 157-174 (2009).
- Harmsen, M. M., De Haard, H. J. Properties, production, and applications of camelid single-domain antibody fragments. Applied Microbiology and Biotechnology. 77 (1), 13-22 (2007).
- McMahon, C., et al. Yeast surface display platform for rapid discovery of conformationally selective nanobodies. Nature Structural & Molecular Biology. 25 (3), 289-296 (2018).
