アルパカ (ラーマ pacos) 蛋白質の抗原と抗原特異的単一ドメイン抗体産生の予防接種

ケンタッキー大学機関動物ケアおよび使用委員会 (IACUC) によって承認プロトコル (2017-2627 と 2018-2925) に従って、アルパカとすべてのプロシージャを行った。 1. アルパカ抗原特異的抗体の生成 アルパカ処理と一般的な考慮事項 適切な制度や規制の承認を得る。 大人のアルパカを取得 10 歳未満、体の状態、少なくとも 3.0 (スケール 1-5)12のスコア。彼らは群れの動物なので一緒に 2 つ、できれば 3 つの動物の最小を家します。注:男性は一般よりも気質を持っているし、働き易いので、推奨されます。 食事、住宅、予防接種、寄生虫制御プログラム13のレビューを含む獣医の検査を通して動物の健康状態を確認します。動物専門獣医の推薦に基づいて地理的な地域に適切なワクチン接種を最新にことを確認します。起源および特定のローカル条件13の群れの歴史のレビューに基づく獣医と相談の外、棲制御プログラムを開発します。 少なくとも 1 週間に慣らす、トレーニングや拘束への露出にホルターを含みます。 事前予防接種コントロールとして使用のための血清を取得する 4 mL の血液サンプルを収集 (手順 1.4 参照)。血清を凍結し、0.5 ml に-20 ° C で保存します。注:この時、動物の初期状態を監視する完全な血球 (CBC) 分析のため追加の血液を取得できます。 抗原の準備 リン酸緩衝生理食塩水 (PBS) または HEPES 緩衝生理食塩水 (HBS) の浄化された蛋白質の抗原の準備し、≥ 1 mg/mL に集中。予防接種、パン、およびクローンの確認を含む、完全なプロトコルのタンパク質の約 3 mg が必要です。注:ラクダ科動物抗体は特異性抗原タンパク質選択性を表示が、非構造化タンパク質またはペプチド認識する抗原は一般に構造のよく適している一般的に。 純度の抗原純度を確立 > 必要な 90%。SDS ページなどの分析方法を利用します。注意:他の蛋白質の重要な汚染は、単一ドメイン抗体が標的蛋白質よりもむしろ汚染物質を分離することができます選択時に問題につながることができます。 抗原の 100 μ g の合計を含む抗原の冷凍の因数を準備します。2 mg/mL 製剤の 50 μ L です。1 mg/mL の 100 μ L は、予防接種のために適した最も希薄蛋白質溶液です。また、抗原がフリーズ/フリーズ解除を受けることができない、ソリューションの長期的に安定する知られている格納できます 4 ° C で注:抗原は凍結/解凍サイクルを受けることができるようにテスト抗原の 20 μ L 因数はシンに分配する必要があります壁 PCR チューブとスナップを液体窒素で凍結します。チューブを解凍、実行高速遠心分離、紫外・可視吸収凍結の前後を比較することによってまたは SDS ページのゲルを実行することによって定量回復を確認してください。可能であれば、抗原も生物学的活性の保持のためテストする必要があります。凍結融解サイクルが成功、残りの抗原がスナップ 100 μ 因数で凍結し、-80 ° C で保存20% までの添加とプロトコルを繰り返すことができます凍結/融解サイクルに問題がある場合グリセリン。 予防接種 最大 5 つの抗原、それぞれ 200 μ g をミックス 300 に 1,000 μ L の間の最終的な容積のアジュバント。アジュバントは、希釈剤として水を使用して最終巻の: 50% を構成する必要があります。注:バッファーが必要な場合は、グリシンやモップ、HEPES を使用します。5 と 6 の間の pH は、中立なより好ましいするよく証明しています。血液凝固を引き起こすことができるので、リン酸塩やクエン酸塩など多価イオンを避けてください。 弓リンパ節に隣接する地域を公開する肩に肩から首の基本に沿って三日月パターンでの電気バリカンでアルパカの毛をトリミングします。 アルパカの首を持ち、ゆっくりと 22 G 針を使用してボー リンパ節に近い首の付け根に沿って皮下抗原を注入します。5 注射 〜 200 μ L の (または少ない) 実行 〜 5 cm。注:動物は、注射時に 2 番目のスタッフ メンバーによって抑制する必要があります。注入して蹴り、後ろからだけないが、横になりやすいので注意をアルパカ呼び出しを出血します。手続き中にグループでは、お互いに近い動物を持っていることが最適です。彼らは群れの動物が、彼らはグループの穏やかなより少なく強制的な拘束が手続き中に必要があります。 アナフィラキシーの兆候を 〜 20 分ポスト注入のための動物を監視 (1.6 ステップを参照してください)。毎週、注射部位でローカライズされた炎症のモニターであり、推奨されるアジュバントを使用するときではありません。注射部位から血液の漏れが過剰ではないことを確認します。 毎週各抗原の 100 μ g を使用して混合物の 5 以降高める注射を実行します。注射部位の毛をクリッピング季節に応じて毎週必要があります。秋と冬は、動物の毛が急速に成長することができます。 採血 クリップ、アルコール綿棒でコレクション サイトを消毒してください。 直立させて首とストレートでゆっくり動物を抑制します。注:動物は、ビデオに示すように手動で拘束されたことができます。可能な場合、出血中にアルパカを抑制するアルパカ シュートの使用し、注射処理を緩和することができます。アルパカ シュートを使用するには、haltered アルパカはシュートにつながった、首バーとクイック リリースのストラップに拘束されました。アルパカ シュートのバージョンは、商用ベンダーから入手可能です。 椎骨の横突起の腹側の投影を使用すると、ランドマークとして、腹側のプロセスにちょうど内側の圧力を適用することによって静脈を閉塞します。注:大人のアルパカで異なる頸溝はありません。頸静脈は、横の椎骨プロセスの腹側突起によって保護されます。この厚い皮 (例えば、「プレートの戦い」男性の首の中間の 1/3 以上厚さ 1 cm) を視覚化または頸静脈自体を触診するが困難な頚部の筋と。その後、椎骨のランドマークの使用は、内頸静脈の場所の最も有用な指標です。 若干内側 45 ° の角度で針を挿入 (~ 指幅) 首の中心に向かって投影します。血流まで針を操作します。注:内頚静脈と総頚動脈は、お互いの近くにあります。静脈血はかなり色の赤が動脈血よりもまだ暗いです。次のコレクション、圧力は 0.5-1 のサイトに適用されるべき分 (または頸動脈にアクセスする場合より長い) 止血が保証されるまで。 分析目的のため 4-10 ミリリットルの血液を描画します。適切なサイズのシリンジや採血管と 1.5 インチ、通常組み合わせて 20 G 針を利用します。ラベンダー トップ K2EDTA 管リンパを浄化するときに全血を収集するために利用します。血清の生産のために血液を収集するときは、ゴールド トップ血清分離チューブ (BD) を利用します。 生産目的のため血液の 50-100 mL を描画します。セットに「蝶」19 20 G 翼輸液セット追加 12 インチ注入拡張子を使用。注:拡張設定では、採取針の安定化に焦点を当てる venipuncturist を許可する複数の血液採血管を埋めるためアシスタントをことができます。輸液セットの追加動物 (手順 3-5 分) の潜在的な動きに対応、オペレーターの快適な作動距離を与えます。 免疫モニタリング 3rdと 5th注射後 3 〜 4 日は、テストの血清を得るそれぞれの動物から小さなテスト ブリードを実行します。凍結し、0.5 ml の血清を保存します。前述の通り、動物の健康を監視するため同時に追加の血液サンプルを取得します。 前免疫、3 週、5 週の時点でテスト出血から得られた血清を用いた elisa 法による抗原特異的抗体の存在を確認します。抗体価はまだ増加している最終的なブリードを取ることをお勧めします。 表面処理の 96 ウェル プレートを用いた抗原親和性板を生成します。100 mM 炭酸ナトリウム緩衝、pH 9.0 における抗原の 0.1 μ g を希釈します。各ウェルに 100 μ L のソリューションを追加し、4 ° C で一晩インキュベート各抗原の 10 希釈液は、複製でテストされます。空白のコントロールはよく炭酸バッファーのみでコーティングされて準備です。 一晩インキュベートした後反転井戸の内容を削除し、0.1 mL の PBS、0.1% で 3 回洗ってプレート トゥイーン 20 (PBS-T)。 PBS T で BSA (5 mg/mL) の 0.1 mL を追加し、室温で 1 時間プレートを培養して井戸をブロックします。 井戸の中に洗浄液をピペッティングし、プレートのインバージョンによる洗浄ソリューションを削除 PBS T を 3 回、洗浄します。 100 分の 1 のと最大開始希釈を使用して PBS T バッファー前免疫と免疫血清の各 0.3 mL の 2 倍のシリアル希薄を準備 1/102, 400。 井戸に各希釈の 100 μ L を追加し、室温で 2 時間インキュベートすることができます。 各ウェルから血清を外し、3 回 0.2 ml の PBS T の洗浄します。 それぞれをインキュベート 1 h の 1:20,000 の希釈で HRP 標識ヤギ抗ラマ IgG 抗体の 0.1 mL でも。注:測定免疫応答には、重鎖だけ抗体、循環3,14でほぼ同じ比率で存在しているだけでなく、従来の両方が含まれます。 抗体溶液を外し、それぞれ洗浄も 0.2 ml の PBS T の 3 回。 発色性ペルオキシダーゼ基質の 100 μ L を追加、2 つの最高の集中点の強度が飽和状態になる、これは通常 5-10 分まで室温で孵化させなさい。 反応を停止する各ウェルに 0.1 M 硫酸の 100 μ L を追加します。 450 各ウェルの吸光度を測定プレート リーダーを使用して nm。 関数の濃度と吸光度をプロットします。 アルパカの監視および潜在的な合併症 適切なアルパカ プロシージャ全体の監視を確認します。注:手順は、重要な副作用を引き起こすことは期待されていません。動物の幸福と健康監視してください毎日の飼育や研究者給餌・給水します。Unalleviated の実験、または自発的な自然罹患率と任意の動物によって付託されなければならない評価のため獣医サービス人道的な安楽死まで、適宜示されています対人で必要な場合。瀉血療法に関連付けられている潜在的な悪影響は、出血、あざや血腫です。20 分ポスト血液出血の兆候を探すため動物を監視する必要があります。サイトに追加の圧力を使用する必要があります。出血が停止しない場合は、獣医師に連絡しています。注射や出血に関連付けられている他の潜在的な悪影響には、肉芽腫形成と炎症が含まれます。肉芽腫形成は想定されていませんし、ケンタッキー州の大学ではみられていません。インジェクション サイト炎症 (発赤や腫れ) が発生して獣医師の注意に持って来られるべきであります。生産出血は血の潜在的重要なボリュームを表し、動物は採血後安定した、アクティブであることを保証するために監視する必要があります。アナフィラキシーと発熱性の応答は 2 つの可能性が最も高い深刻な不利な結果ですが、あまり見られなきます。それが発生したアナフィラキシーは抗原注射の直後に発生して、直腸温、弱さ、嘔吐、呼吸困難、または下痢の増加によって明示されます。体温の増加を検出する各投与、直腸温を監視できます。これらが認識される場合は、相談のためにすぐに獣医を通知します。さらに、緊急「クラッシュ キット」(例えば、エピネフリン、副腎皮質ステロイド、抗ヒスタミン薬) 獣医師との相談で準備は副作用を持っていることの疑われる動物の治療に利用可能なはずです。 2. 単一ドメイン抗体ライブラリーの構築のリンパ球を浄化 (を参照してくださいステップ 1.4) の最後の注射後 3 〜 5 日 50 ミリリットルの血液を収集します。注:血を高速処理し、RNA の隔離得る適切なライブラリ サイズ15、3、パンの成功にとって非常に重要であることが重要です。 5 mL の PBS と集められた血の 15 mL を希釈します。 メーカーの提案によると密度勾配遠心による末梢血リンパ球 (Pbl) を分離するためのリンパ球分離管を利用します。注意:製造元の指示を示す最大 25 ミリリットルの血液を使用できます、しかし、このシステムを飽和させるし、きれいなリンパ球の準備を得ることを防ぐため。 5 mL の PBS PBL に 4 ° C に prechilled を追加します。 4 ° C で 800 x gで 20 分間スピンします。 5 mL の PBS の 4 ° C で 800 x gで 20 分間遠心分離によって続いて PBL に 4 ° C に prechilled を追加することによって 2 回を洗う 製造元の指示に従ってスピン列に基づいてシステムを使用して総 RNA を分離します。適切なバッファーおよび生体高分子破砕システムへの適用で vertexing で細胞をホモジナイズしてください。ミニかマキシ列入力セルに基づいての適切な数を使用します。 オリゴ (dT) の 0.1 μ g のミックスと 12-18 プライマー RNA の 10 μ g を組み合わせることで逆転写酵素を使用して cDNA を合成します。 確立された方法4を使用してバクテリオファージ ライブラリを生成します。これは、挿入の糸状のバクテリオファージ バクテリオファージ ソリューションの生産のための III の遺伝子融合の式に続いてバクテリオファージ表示ベクトル pMES4 への制限の酵素とクローニングを伴います。 3. ドメインの単一抗体パン 表面処理の 96 ウェル プレートを用いた抗原親和性板を生成します。100 mM 炭酸ナトリウム緩衝、pH 9.0 における抗原の 0.25 μ g を希釈します。各ウェルに 100 μ L のこのソリューションを追加し、4 ° C で一晩インキュベート抗原ごと 2 つの井戸をコートします。炭酸バッファーのみでコーティングされ、空白のコントロールをよく準備します。注:プレートを生産し、選択の複数のラウンドを行う場合 4 ° C で最大一週間保存できます。また、このメソッドは、ビオチン化または他のタイプ分類の戦略の他のメソッドを使用して、ラベルを必要としない直接吸収を利用しています。 プレートを一晩インキュベートします。井戸の内容を削除し、PBS T の 0.1 mL で 3 回洗って反転します。 PBS で BSA (20 mg/mL) の 0.1 mL を追加し、室温で 2 時間プレートを培養して井戸をブロックします。 PBS T PBS で 3 回続くと 3 回、洗浄します。抗原も共有ラベルして使用できるなど、たとえば、ストレプトアビジン/ビオチン システム キャプチャ システムで。 あらかじめ室温 30 分間振動プラットフォームで PBS の BSA の 40 mg を mL の 100 μ L とファージ液 (100 μ L) を扱います。 抗原にバクテリオファージ ソリューション井戸をコーティング、室温で 2 時間のために穏やかな攪拌と孵化を追加します。各抗原のための 10 の11バクテリオファージの合計を確保するために複数の井戸を使用します。 逆解析による非連結のバクテリオファージを破棄し、5 回で 200 μ L の PBS T PBS で 5 回続いて井戸を洗浄します。 PBS と 700 rpm で振動プラットフォームで室温で 30 分間インキュベート 0.25 mg/mL のトリプシンの 0.1 mL を追加することでバインドされたバクテリオファージを溶出します。 トリプシン活性をクエンチする 4 mg/mL 4 ベンゼンスルホニル フッ化 hydrochloride(AEBSF) ソリューションの 5 μ L を含むバイアルにソリューションを転送します。 外径 φ600まで揺れで 37 ° C で TG1 バクテリオファージ表示有能なセルの成長 = 0.5。 TG1 細胞の 3 mL に溶出したファージの 50 μ L を追加します。 37 ° C で 30 分間振盪せず孵化させなさい。 7 mL の LB 培地 100 μ g/mL アンピシリン、2% グルコースを追加します。 37 ° C で一晩を振る注:最も多様な単一ドメイン抗体を得るためには、クローンは、シーケンスができます、目的のプロパティのためにテストし、パンの 1 つのラウンド後に利用します。単一のドメイン抗体の高い親和性を得る、パンの 2 つのラウンドを活用すべき。 LB 寒天培地プレート上一晩成長が 100 μ g/mL アンピシリン、2% グルコースを添加した後、細菌をプレートします。いくつかのシリアル希薄がテストする必要があります 2 つの希釈で開始、1/10,000 と 1 の 100 μ L をめっき/100,000 希薄。 37 ° C で一晩プレートを孵化させなさい コロニーをピックアップし、100 μ g/mL アンピシリン、2% グルコース、ウェルあたり 10 %v/v グリセロール 2XYT の 100 μ L を含む滅菌 96 ウェル プレートの井戸を接種します。 振動なしの 37 ° C で一晩インキュベートします。 次の日は 37 ° C, 60 分で 170 回転で振る。 PCR チューブに 2 μ L のメディアを削除します。プレートの左し 1 〜 2 日のための 4 ° C で保存またはと冷凍保存用-80 ° C で保存することができます残りの溶液。 ベクトルの利用のために適切なプライマーを用いた PCR の反作用を実行します。肯定的なクローンを使用してプライマー多重クローニング サイトに逃げの PCR のスクリーニングは pMES4、CCTATTGCCTACGGCAGCCGCTGGATTGTTATTAC、GGTGGTGTGAGGAGACGGTGACCTG。ポリメラーゼの使用、57 ° C と 30 サイクルのアニール温度サイクリング条件適切な利用します。 1% (w/v) agarose のゲルを実行することによって PCR 反応を分析します。肯定的なコロニーがある単一ドメイン抗体遺伝子挿入 〜 500 の跪く肯定的なクローンのサンプルの 20-50% を確保。注:このメソッドは、選択とほとんどの研究室で実行することができます分析、クローンの手段を提供します。また、次世代シーケンサーが適用でき、統計と比較解析16を許可する大規模なデータセットを提供します。 100 μ g/mL アンピシリンとポンドの 7 mL を含む新鮮な管にプレートから肯定的なクローンを接種します。 37 ° C で一晩の揺れと成長します。 プラスミド DNA を取得する文化で、miniprep を実行します。 配列のプライマー pEX Rev (CAGGCTTTACACTTTATGCTTCCGGC) 標準を使用して肯定的なクローンをシーケンスします。 結果のシーケンスを 1 つのドメイン抗体の解析を実行します。フレーム シフトまたは終止コドンがないことを確認します。 類似性と多様性の結果のシーケンスを分類します。繰り返し識別されるシーケンスは、最も特に選択の 2 つのラウンドの後、親和性が高いバインド シーケンスをする可能性があります。 エクスプレスの BL21 派生式ひずみを用いた単一ドメイン抗体大腸菌。22 ° C で一晩成長 IPTG の添加で発現を誘導します。 固定化金属アフィニ ティー ・ クロマトグラフィー (IMAC) を使用して単一ドメイン抗体を浄化します。 プルダウン、ネイティブのゲルの電気泳動や elisa 法などの直接的な相互作用アッセイを用いた単一ドメイン抗体/抗原結合を検証します。 特定の実験に応じて、アプリケーション固有の単一ドメイン抗体のパフォーマンスを確認します。