Иммунизации альпаки (лама pacos) с белков антигенов и производства антиген специфические антитела одного домена

Все процедуры с альпаки были выполнены в соответствии с протоколами (2017-2627 и 2018-2925) утвержденных Университета Кентукки институциональный уход животных и использование Комитет (IACUC). 1. поколение Альпака антиген специфические антитела Альпака обработки и общие соображения Получите соответствующие институциональные и/или регулирующие одобрение. Получить взрослых альпак, менее чем в 10 лет возраста с телом состоянии балл по крайней мере 3.0 (шкала 1-5)12. Потому что они стадо животных, дом не менее двух, но предпочтительно трех животных вместе.Примечание: Мужчины, рекомендуется, потому что, в целом, они имеют более даже темперамент и легче работать с. Проверьте состояние здоровья животных через ветеринарной экспертизы, включая обзор диеты, жилье, вакцинации и паразит Управление программы13. Убедитесь, что животные находятся в курсе соответствующих местных географического региона, на основе профессиональных рекомендаций ветеринарной вакцинации. Разработать программу управления экто – и endoparasite в консультации с ветеринаром, на основе анализа истории стадо происхождения и13конкретных местных условий. Акклиматизироваться на по крайней мере одну неделю, включая подготовку Холтер и подверженности сдержанность. 4 мл пробы крови для получения сыворотки для использования в качестве элемента предварительной иммунизации (см. шаг 1.4). Sera заморозить и хранить при температуре-20 ° C в 0,5 мл аликвоты.Примечание: В это время дополнительные крови могут быть приняты для анализа полной клеток крови (CBC) для мониторинга состояния первоначального здоровья животных. Подготовка антигена Подготовить очищенный протеин антигенов в фосфат амортизированное saline (PBS) или HEPES-амортизированное saline (ХБС) и сосредоточиться на ≥1 мг/мл. Приблизительно 3 мг белка требуется полный протокол, включая иммунизацию, панорамирование и подтверждения клонов.Примечание: Верблюдовые антитела отображать высокая специфичность и избирательности против белков антигенов, но обычно не очень хорошо подходят для неструктурированных белков или пептидные антигены, которые обычно неструктурированные. Создание чистоты антигена, с чистотой > 90% желаемого. Используйте аналитический метод как SDS-PAGE.ОСТОРОЖНОСТЬЮ: Значительное загрязнение с другими белками может привести к проблемам во время выбора где одного домена антитела могут быть изолированы от загрязнений, вместо того, чтобы целевого белка. Готовить замороженные аликвоты антиген, который содержит в общей сложности 100 мкг антигена. 50 мкл 2 мг/мл препарата является идеальным. 1 мг/мл 100 мкл является наиболее разбавленный раствор белка, подходит для иммунизации. В качестве альтернативы если антиген не может пройти замораживания/оттаивания и известно для быть стабильным в долгосрочной перспективе решение, он может храниться при 4 ° C.Примечание: Чтобы убедиться, что антиген может пройти цикл замораживания/оттаивания, теста, которую следует отказаться от 20 мкл Алиготе антигена в тонкой стеной ПЦР-пробирку и оснастки, замороженные в жидком азоте. Оттепель трубки, выполняют высокая скорость центрифугирования и проверить количественные восстановления путем сравнения поглощения УФ-вид до и после замораживания или запустив геля SDS-PAGE. Если это возможно, антиген должен также испытываться для сохранения биологической активности. Если цикл оттаивания замораживание успешно, оставшиеся антигена является оснастки заморожены в 100 мкл аликвоты и хранятся при температуре-80 ° C. Если имеются проблемы с циклом замораживания/оттаивания, протокол может быть повторен с добавлением до 20% глицерина. Иммунизация Смешайте до пяти антигенам, 200 мкг каждая, с адъювантом в окончательном объеме между 300-1000 мкл. Адъювант должны составлять ≥50% от окончательного объема с использованием воды в качестве разбавителя.Примечание: Если буфер, используйте HEPES, швабры или глицин. РН между 5 и 6 часто оказалась более благоприятным, чем строго нейтральной. Избегайте поливалентная ионы фосфата или цитрат, так как они могут спровоцировать коагуляции. Подстригать волосы альпаки с Электрические ножницы, в шаблоне полумесяц вдоль основания его шеи от плеча к плечу подвергать в регионах, прилегающих к носовой лимфатических узлов. Удерживая альпаки шею, медленно внедрять антигена подкожно вдоль основания шеи вблизи бант лимфатических узлов с помощью иглой 22 G. Выполните пять инъекции ~ 200 мкл (или меньше) ~ 5 см друг от друга.Примечание: Животные должны сдерживаться второго сотрудника во время инъекции. Инъекций и кровотечение альпак призывает к осторожности, поскольку они склонны к ногами, не только из-за, но боком. Имея животные близко друг к другу, в группе, во время процедур является оптимальным. Учитывая, что они являются стадо животных, они спокойнее в группе и менее сильный сдержанность необходима во время процедур. Мониторинг животных для инъекций пост ~ 20 мин для признаков анафилаксии (см. шаг 1.6). Монитор для локализованные воспаление на инъекции еженедельно, который не ожидается при использовании рекомендуемых адъюванта. Убедитесь, что утечки крови от места инъекции не является чрезмерным. Выполните пять последующих повышение инъекции еженедельно с использованием 100 мкг каждая антигена в смеси. Стрижки волос на участках инъекции могут потребоваться каждую неделю в зависимости от сезона. Осенью и зимой волос животных может быстро расти. Рисунок крови Клип и лечить сайт коллекции с алкоголем тампоны. Нежно сдерживать животное с шеи, состоявшейся в вертикальном положении и прямой.Примечание: Животные могут удерживаться вручную, как показано в видео. Если возможно, использовать Альпака желоба сдерживать альпак во время кровотечения и инъекции может облегчить обработку. Чтобы использовать парашют Альпака, haltered альпак привели в лоток и сдержанной с шеи баров и ремни с быстрой релизы. Доступны версии Альпака желоба от коммерческих поставщиков. Используя брюшные проекцию поперечного отростка позвонка как ориентир, загородить Вену, применяя давление просто медиальной вентральной процесса.Примечание: Существует без собственный югулярной борозды в взрослых Альпака. Яремной вены находятся под защитой брюшной прогнозы поперечной позвоночного процессов. Этот толстой кожи (например, 1 см толщиной, «борьба плита» над средней 1/3 шеи у самцов) и мускулатура шеи делает его трудно визуализировать или пальпировать яремной сам. Впоследствии использование позвоночных достопримечательности является наиболее полезные показатели югулярной местоположения. Вставьте иглу под углом 45° слегка медиальной (~ палец ширина) к проекции к центру шеи. Манипулировать иглы до потоки крови.Примечание: Яремной вены и сонной артерии находятся близко друг к другу. Венозная кровь может быть довольно красного цвета, но все еще темнее, чем артериальной крови. После завершения сбора, давление должно применяться к сайт для 0,5-1 мин (или дольше, если доступ к сонной артерии) до тех пор, пока заверил гемостаз. Рисование 4-10 мл крови для аналитических целей. Использовать 1,5 дюйма, иглы 20 G обычно в сочетании с соответствующего размера шприца или пробирки. Используйте лаванды Топ K2ЭДТА трубы для сбора цельной крови, когда очищать лимфоцитов. Используйте золото Топ сыворотки разделение трубы (BD), когда сбор крови для производства сыворотки. Нарисуйте 50-100 мл крови для производственных целей. Используйте дополнительные вливания 12-дюймовый расширение установлено с 19-20 G крылатый «бабочка» настой.Примечание: Расширение набора конфигурации позволяет помощник для заполнения нескольких пробирки, позволяя venipuncturist сосредоточиться на стабилизацию коллекции иглы. Добавление инфузионный набор рассчитан потенциал движения животного (процедура 3-5 мин) и обеспечивает комфортную рабочую дистанцию для операторов. Иммунной наблюдения Три-четыре дня после 3rd и 5й инъекции, выполните небольшой тест кровоточить от каждого животного для получения сыворотки для тестирования. Заморозить и хранить sera в 0,5 мл аликвоты. Получение дополнительных крови в то же время для мониторинга состояния здоровья животного, как обсуждалось выше. Подтвердите наличие антиген специфические антитела, ELISA, используя sera, полученные из теста кровоточит в точках времени предварительно иммунной, три недели и пять недель. Это лучше всего взять окончательного выпуска за обрез, в то время как все еще растет титр антител. Генерировать антигена сродство пластины с помощью поверхности обработанной 96-луночных пластины. Разбавьте 0,1 мкг антигена в 100 мм карбонат натрия буфера, рН 9,0. Добавить 100 мкл раствора в каждой скважине и инкубировать на ночь при 4 ° C. Десять разведений каждого антигена тестируются в двух экземплярах. Пустой элемент управления хорошо подготовлен, покрытый карбонат только буфера. После ночи инкубации, инвертировать пластину удалить содержимое скважин и мыть три раза с 0,1 мл PBS, 0.1% 20 анимации (PBS-T). Блокировать скважин, добавляя 0,1 мл (5 мг/мл) BSA в PBS-T и инкубации пластину за 1 ч при комнатной температуре. Промойте пластины три раза с PBS-T закупорить промывочного раствора в скважину и удаляя промывочный раствор путем инверсии пластины. Подготовка два раза серийных разведений 0,3 мл каждый из предварительно иммунитета и иммунной сыворотки в буфере PBS-T с помощью начального разбавления 1/100 и до 1/102, 400. 100 мкл каждого разведения к скважинам и позволяют Проинкубируйте втечение 2 ч при комнатной температуре. Удаление сыворотки из каждой скважины и мыть с 0,2 мл PBS-t три раза. Инкубировать каждый хорошо с 0,1 мл HRP-конъюгированных коза анти ламы IgG антител при разбавлении топографической за 1 час.Примечание: Иммунный ответ измеряется включает в себя как обычных, а также тяжелые цепи только антитела, которые присутствуют в примерно равные показатели в обращении3,14. Удалить раствор антител и мыть каждый хорошо с 0,2 мл PBS-t в три раза. 100 мкл пероксидазы Хромогенный субстрат в колодец и инкубации при комнатной температуре до тех пор, пока интенсивность двух высоких точек концентрации насыщения, которые обычно занимает 5-10 мин. Добавьте 100 мкл 0,1 М серной кислоты в каждой скважине для остановки реакции. Измерение поглощения каждой скважины на 450 Нм, с помощью пластины читателя. Участок поглощения как функция концентрации. Альпака мониторинга и потенциальные осложнения Обеспечить надлежащие Альпака, мониторинг во всей процедуре.Примечание: Процедуры не ожидается вызывать серьезные неблагоприятные последствия. Здоровья и благополучия животных должен контролироваться ежедневно животноводства и/или исследований персонала во время кормления и поения. Любое животное с unalleviated экспериментально индуцированной или спонтанных естественных заболеваемости должны передаваться для оценки ветеринарных служб с место, предоставляет в соответствующих случаях, до гуманного эвтаназии, при необходимости.Потенциальные негативные последствия, связанные с кровопускания являются кровотечение, ушибы и гематомы. Животные должны быть проверены на 20 мин пост крови обратить искать признаки кровотечения. Следует использовать дополнительное давление на сайтах. Если кровотечение не прекращается, ветеринар должен быть контакт.Другие потенциальные негативные последствия, связанные с инъекциями и кровотечение включают формирование гранулемы и воспаления. Гранулема формирования не предполагается и не наблюдалось в университете Кентукки. Инъекции сайте воспаления (покраснение или припухлость) может произойти и должно быть обращено внимание ветеринара. Обрез производства представляет собой потенциально значительный объем крови, и животные должны контролироваться заверить, что они являются стабильными и активной после забора крови.Анафилаксия и пирогенных ответы являются двумя наиболее вероятно серьезные негативные последствия, но очень редко соблюдаются. Если это происходит, анафилаксия произойдет вскоре после инъекции антигена и проявляется увеличением ректальной температуры, слабость, рвота, проблемы с дыханием или диарея. Ректальной температуры может отслеживаться после каждой инъекции для обнаружения любого увеличения температуры тела. Если они признаются, уведомите ветеринар немедленно для консультации. Кроме того аварийный «Crash комплект» (например, адреналин, кортикостероиды и антигистаминный препарат) подготовила в консультации с ветеринаром должны быть доступны для лечения животных, подозреваются неблагоприятные реакции. 2. Очищение лимфоцитов для одного домена антитела библиотека строительства Соберите 50 мл крови три-пять дней после последней инъекции (см. шаг 1.4).Примечание: Быстрая обработка крови и изоляции РНК имеет важное значение для получения подходящей библиотеки размер15,3, что является очень важным для успеха панорамирование. Развести 15 мл с 5 мл PBS собранной крови. Используйте трубу разделения лимфоцитов изолировать лимфоцитов периферической крови (PBLs), плотность градиентного центрифугирования согласно производит предложения.ОСТОРОЖНОСТЬЮ: Инструкции производителя указывают, что до 25 мл крови могут быть использованы, но это может насытить системы и предотвращения получения чистой лимфоцитов препарат. Добавьте 5 мл PBS, prechilled до 4 ° C до ПБЛ. Спина на 20 мин в 800 x g при 4 ° C. Мыть два раза, добавив 5 мл PBS, prechilled до 4 ° C до ПБЛ последующим центрифугированием на 20 мин в 800 x g при 4 ° C. Изолируйте всего РНК с помощью спин столбца на основе системы, согласно инструкциям производителя. Однородный клетки, vertexing в соответствующий буфер и применяя систему измельчения биополимера. Используйте соответствующее количество мини и макси столбцы, основанные на ячейку ввода. Синтез cDNA, с помощью обратной транскриптазы, объединяя 10 мкг РНК с сочетанием 0,1 мкг Oligo (dT) 12-18 грунтовки. Создания библиотеки бактериофага, используя установленные методы4. Это включает клонирование с энзимами ограничения в Фаговые отображения векторных pMES4 следуют выражение insert сливается с Джин III нитчатые ФАГ для производства раствора ФАГ. 3. одного домена антитела панорамирование Производят антигена сродство пластины с помощью поверхности обработанной 96-луночных пластины. Разбавьте 0,25 мкг антигена в 100 мм карбонат натрия буфера, рН 9,0. Добавить 100 мкл этого решения в каждой скважине и инкубировать на ночь при 4 ° C. Герб две скважины на антиген. Подготовьте пустой элемент управления хорошо, покрытый карбонат только буфера.Примечание: Пластины могут быть произведены и хранятся до одной недели при температуре 4 ° C, если будет выполнено несколько раундов выделения. Кроме того этот метод использует Прямая абсорбция, которая не требует маркировки в то время как другие методы используют biotinylation или другие виды маркировки стратегии. Инкубируйте пластину на ночь. Инвертировать удалить содержимое скважин и мыть три раза с 0,1 мл PBS-t. Блокировать скважин, добавляя 0,1 мл BSA (20 мг/мл) в PBS и инкубации пластину для 2 ч при комнатной температуре. Вымойте тарелку три раза с PBS-T следуют три раза с PBS. Антигены могут также ковалентно помечены и используется в системах улавливания таких, к примеру, стрептавидина/биотина систем. Предварительно лечения Бактериофаг решение (100 мкл) с 100 мкл 40 мг/мл BSA в PBS на вибрирующей платформе при комнатной температуре за 30 мин. Добавьте решение фага к антигену покрытием скважин и проинкубируйте с нежным агитации за 2 ч при комнатной температуре. Используйте несколько скважин с целью обеспечить в общей сложности 1011 Фаговые для каждого антигена. Отказаться от несвязанных фага, инверсии, а затем вымыть колодцы пять раз с 200 мкл PBS-T, а затем пять раз с PBS. Элюировать привязанного фага, добавив 0,1 мл 0,25 мг/мл трипсина в PBS и инкубировать в течение 30 мин при комнатной температуре на вибрирующей платформе 700 об/мин. Решение передать флакон с 5 мкл 4 мг/мл 4-benzenesulfonyl фторид hydrochloride(AEBSF) решения для утоления активности трипсина. Расти TG1 Фаговые дисплей сведущие клетки при 37 ° C при встряхивании до од600 = 0.5. Добавьте 50 мкл eluted Фаговые 3 мл TG1 клеток. Инкубируйте при 37 ° C без встряхивания в течение 30 мин. Добавление 7 мл LB СМИ, дополняется 100 мкг/мл ампициллин, 2% раствор глюкозы. На ночь погрозит 37 ° C.Примечание: Для получения самых различных антител одного домена, клоны можно виртуализировать, тестирование на желаемые свойства и использовать после одного раунда панорамирования. Для получения высоких сродства антител одного домена, следует использовать два раунда панорамирование. Пластина бактерии, после ночи роста на плитах агара LB дополнена 100 мкг/мл ампициллин, 2% раствор глюкозы. Несколько серийных разведений нужно будет испытываться, начиная с двух растворов, покрытие 100 мкл 1/10 000 и 1/100 000 разведениях. Инкубировать пластину на ночь при 37 ° C. Выберите колоний и прививать скважин стерильные 96-луночных пластины, содержащей 100 мкл 2XYT с 100 мкг/мл ампициллин, 2% раствор глюкозы 10% v/v глицерина в хорошо. Инкубируйте на ночь при 37 ° C без встряхивания. Следующий день, поколебать на 170 об/мин при 37 ° C 60 мин. Удалите 2 мкл СМИ в ПЦР-пробирки. Оставшийся раствор может оставил в пластине и хранить при 4 ° C для 1-2 дней или замороженных и температуре-80 ° C для последующего использования. Выполняйте реакции PCR с праймерами для вектора использованы. Для pMES4 скрининг PCR праймеров использует положительных клоны, которые обрамляют несколько клонирования сайта являются CCTATTGCCTACGGCAGCCGCTGGATTGTTATTAC и GGTGGTGTGAGGAGACGGTGACCTG. Используйте Велоспорт соответствующие условия для полимеразы, отжига температура 57 ° C и 30 циклов. Анализ реакции PCR, запустив гель агарозы 1% (w/v). Колоний, которые являются положительными у одного домена антитела гена вставки ~ 500 bp. обеспечить позитивные клоны 20-50% выборки.Примечание: Этот метод предоставляет средства для клона, отбора и анализа, которые могут быть выполнены в большинстве исследовательских лабораториях. Кроме того секвенирование нового поколения может быть применен и обеспечивает большие наборы данных, которые позволяют статистической и сравнительный анализ16. Прививать положительные клоны от пластины в свежие пробирки, содержащие 7 мл фунтов с 100 мкг/мл ампициллина. Расти с встряхивания для ночлега на 37 ° C. Выполните алкалический на культуру для получения плазмида ДНК. Последовательность положительных клоны с использованием стандарта последовательность праймера pEX-Rev (CAGGCTTTACACTTTATGCTTCCGGC). Выполните Вычислительный анализ на антитела последовательности одного домена. Убедитесь, что есть нет стоп-кодонов или смены кадра. Классифицируйте последовательности для подобия и разнообразия. Последовательности, которые неоднократно идентифицируются, скорее всего, будет высоким сродством привязки последовательности, особенно после двух раундов выделения. Экспресс антител одного домена, с помощью BL21-производные выражение штамм E. катушки. Побудить выражение путем добавления ИПТГ, растущих на ночь в 22 ° C. Очищение антитела один домен, с использованием иммобилизованных металла аффинной хроматографии (ИАЦ). Проверка одного домена антитела/antigen привязки с помощью прямого взаимодействия пробирного как выпадающее, родной гель-электрофорез, или ELISA. Проверьте производительность антитела один домен приложения, необходимые для конкретного эксперимента.