Immunizzazione di Alpaca (Lama pacos) con gli antigeni della proteina e la produzione di anticorpi di dominio singolo antigene-specifiche

Tutte le procedure con gli alpaca sono state eseguite secondo protocolli (2627-2017 e 2018-2925) approvati dall’Università del Kentucky istituzionale Animal Care ed uso Committee (IACUC). 1. generazione di anticorpi antigene-specifiche Alpaca Gestione degli Alpaca e considerazioni generali Ottenere approvazione istituzionale e/o regolamentazione appropriata. Ottenere gli alpaca adulti, meno di 10 anni di età con un corpo condizione Punteggio di almeno 3,0 (scala 1-5)12. Perché sono animali del gregge, casa un minimo di due, ma preferibilmente tre animali insieme.Nota: I maschi sono raccomandati perché, in generale, hanno un temperamento più uniforme e sono più facili da lavorare con. Controllare lo stato di salute degli animali attraverso una visita veterinaria, ivi compresa la revisione della dieta, alloggio, vaccinazione e parassita controllo programmi13. Assicurarsi che gli animali siano aggiornati con le vaccinazioni appropriate alla regione geografica locale sulla base delle raccomandazioni veterinarie professionale. Sviluppare un programma di controllo di ecto – ed endoparassiti in consultazione con un veterinario sulla base di una revisione della storia dell’allevamento di origine e condizioni locali specifiche13. Acclimatare per almeno una settimana, compresa la formazione di cavezza e l’esposizione a ritenuta. Raccogliere un campione di sangue di 4 mL per ottenere siero per uso come un controllo di pre-immunizzazione (Vedi punto 1.4). I sieri di congelare e conservare a-20 ° C in aliquote di 0,5 mL.Nota: In questo momento, sangue addizionale può essere assunto per un’analisi completa delle cellule del sangue (CBC) monitorare lo stato di salute iniziale degli animali. Preparazione dell’antigene Preparare gli antigeni di proteina purificata in tampone fosfato salino (PBS) o soluzione salina tamponata HEPES (HBS) e concentrarsi a ≥ 1 mg/mL. Circa 3 mg di proteina è necessaria per il protocollo completo, compresi l’immunizzazione, il panning e la conferma dei cloni.Nota: Gli anticorpi camelide visualizzano alta specificità e selettività contro gli antigeni della proteina ma sono generalmente non adatti per le proteine non strutturate o antigeni peptidici che sono generalmente non strutturati. Determinare la purezza dell’antigene, con purezza > 90% desiderato. Utilizzare un metodo analitico come SDS-PAGE.Attenzione: Significativa contaminazione con altre proteine può portare a problemi durante la selezione dove il singolo dominio anticorpi possono essere isolati di contaminanti, piuttosto che la proteina dell’obiettivo. Preparare aliquote congelate dell’antigene che contiene un totale di 100 µ g di antigene. 50 µ l di una preparazione di 2 mg/mL è l’ideale. 100 µ l di 1 mg/mL è la soluzione più diluita di proteina adatta per l’immunizzazione. In alternativa, se l’antigene non può subire gelo/disgelo ed è conosciuto per essere stabile a lungo termine soluzione, esso può essere conservato a 4 ° C.Nota: Per garantire che l’antigene può subire un ciclo di congelamento/scongelamento, prova che un’aliquota di 20 µ l dell’antigene dovrebbe essere erogata in una sottile parete provetta PCR e snap congelati in azoto liquido. Scongelare il tubo, centrifugazione ad alta velocità di eseguire e verificare il recupero quantitativo confrontando assorbimento UV/VIS prima e dopo il congelamento, oppure eseguendo un gel di SDS-PAGE. Se fattibile, l’antigene deve essere testato anche per il mantenimento dell’attività biologica. Se il ciclo Disgelo ha esito positivo, l’antigene restante è snap congelati in aliquote di 100 µ l e conservati a-80 ° C. Se ci sono problemi con il ciclo di congelamento/scongelamento, il protocollo può essere ripetuto con l’aggiunta di fino a 20% glicerolo. Immunizzazione Mescolare fino a cinque antigeni, 200 µ g ciascuno, con adiuvante in un volume finale di tra 300 a 1.000 µ l. L’adiuvante dovrebbe costituire ≥ 50% del volume finale utilizzando l’acqua come diluente.Nota: Se il buffer è necessario, utilizzare HEPES, MOPS o glicina. Un pH compreso tra 5 e 6 ha spesso dimostrato di essere più favorevole di rigorosamente neutrale. Evitare gli ioni polivalenti come fosfato o citrato, poiché essi possono provocare la coagulazione. Tagliare i capelli di alpaca con tagliatori elettrici, a forma di falce di luna lungo la base del suo collo da spalla a spalla per esporre le regioni adiacenti ai linfonodi prua. Tenendo l’alpaca per il collo, iniettare lentamente l’antigene sottocute lungo la base del collo vicino i linfonodi di prua utilizzando un ago 22 G. Eseguire cinque iniezioni di ~ 200 µ l (o meno) ~ 5 cm di distanza.Nota: Gli animali devono essere immobilizzati da un secondo membro del personale durante le iniezioni. L’iniezione e sanguinamento Alpaca invita alla prudenza, poiché essi sono inclini a calci, non solo da dietro, ma lateralmente. Avendo gli animali vicino a vicenda, in un gruppo, durante le procedure è ottima. Dato che sono animali del gregge, che sono più calmi in un gruppo e ritenuta meno forza è necessaria durante le procedure. Monitorare gli animali per ~ 20 minuti dopo l’iniezione per segni di anafilassi (vedere punto 1.6). Monitor per infiammazione localizzata presso i siti di iniezione settimanale, che non è previsto quando si utilizza l’adiuvante consigliato. Garantire che la perdita di sangue dal sito di iniezione non è eccessiva. Eseguire cinque iniezioni d’amplificazione successive settimanale utilizzando 100 µ g di ogni antigene nella miscela. Ritaglio dei capelli presso i siti di iniezione può essere richiesto ogni settimana a seconda della stagione. In autunno e in inverno, i capelli degli animali possono crescere rapidamente. Prelievo di sangue Clip e disinfettare il sito di raccolta con tamponi imbevuti di alcool. Trattenere l’animale delicatamente con il collo tenuto in posizione verticale e dritto.Nota: Gli animali possono essere immobilizzati manualmente, come dimostrato nel video. Se disponibile, utilizzare un scivolo di alpaca per trattenere gli alpaca durante lo spurgo e iniezioni possono facilitare la gestione. Per utilizzare un scivolo di alpaca, alpaca haltered sono portati nello scivolo e trattenuti con collo bar e cinghie con sganci rapidi. Versioni dello scivolo alpaca sono disponibili dai fornitori commerciali. Tramite la proiezione ventrale del processo trasverso delle vertebre come un punto di riferimento, occludere la vena applicando pressione appena mediale al processo ventrale.Nota: Non c’è nessun solco giugulare distinto in alpaca adulto. Le vene giugulari sono protetti da proiezioni ventrale dei processi vertebrali trasversale. Questa pelle spessa (ad es., 1 cm di spessore “piastra di combattimento” sopra il medio 1/3 del collo nei maschi) e la muscolatura del collo rende difficile visualizzare o palpare la vena giugulare stessa. Successivamente, l’uso di punti di riferimento vertebrale è gli indicatori più utili per posizione giugulare. Inserire l’ago con un’angolazione di 45° leggermente mediale (~ dito larghezza) per la proiezione verso il centro del collo. Manipolare l’ago fino a quando il sangue scorre.Nota: La vena giugulare e la carotide sono vicino a vicenda. Sangue venoso può essere abbastanza rosso in colore ma è ancora più scuro di sangue arterioso. Seguito della raccolta, la pressione deve essere applicato al sito per 0,5-1 min (o più se la carotide è letta) fino a quando non è assicurata l’emostasi. Disegnare 4-10 mL di sangue per scopi analitici. Utilizzare un 1,5 pollici, ago 20 G in genere in combinazione con un’apposita siringa dimensione o tubo di raccolta sangue. Utilizzare provette con EDTA di lavanda K2migliori per la raccolta del sangue intero quando i linfociti di purificazione. Utilizzare tubi di separazione del siero superiore oro (BD) quando si raccolgono il sangue per la produzione di siero. 50-100 mL di sangue per la produzione di disegnare. Utilizzare una prolunga infusione supplementare di 12 pollici con un set di infusione di 19-20 G alato “farfalla”.Nota: Un’estensione Imposta configurazione permette un assistente riempire più tubi di raccolta sangue, permettendo il venipuncturist di concentrarsi sulla stabilizzazione l’ago di raccolta. L’aggiunta del set di infusione può ospitare movimento potenziale dell’animale (procedura di 3-5 min) e dà una distanza di lavoro confortevole per gli operatori. Immunitario monitoraggio Tre o quattro giorni dopo il 3rd e 5th iniezioni, eseguire un piccolo test sanguinare da ogni animale per ottenere sieri per il test. Congelare e conservare i sieri in aliquote da 0,5 mL. Ottenere campioni di sangue aggiuntivi allo stesso tempo per monitorare la salute dell’animale, come discusso in precedenza. Confermare la presenza di anticorpi antigene-specifiche da ELISA usando i sieri ottenuti da test sanguina a intervalli di tempo pre-immuni, tre settimane e cinque settimane. È meglio prendere un salasso finale, mentre il titolo dell’anticorpo è ancora in aumento. Generare piastre di affinità dell’antigene con superficie trattate piastre da 96 pozzetti. Diluire 0,1 µ g dell’antigene in tampone carbonato di sodio di 100 mM, pH 9.0. Aggiungere 100 µ l della soluzione ad ogni pozzetto e incubare per una notte a 4 ° C. Dieci diluizioni di ogni antigene vengono testate in duplicato. Un controllo in bianco è ben preparato che è rivestito con tampone di carbonato solo. Dopo l’incubazione overnight, capovolgere la piastra per rimuovere il contenuto dei pozzetti e lavare tre volte con 0,1 mL di PBS, 0.1% Tween 20 (PBS-T). Bloccare i pozzetti aggiungendo 0,1 mL di BSA (5 mg/mL) in PBS-T e incubare la piastra per 1 h a temperatura ambiente. Lavare la piastra tre volte con PBS-T pipettaggio la soluzione di lavaggio nel pozzo e poi rimuovendo la soluzione di lavaggio per l’inversione della piastra. Preparare diluizioni seriali di 0,3 mL ciascuno dei sieri pre-immuni e immuni in tampone PBS-T utilizzando una diluizione iniziale di 1/100 e fino a 1/102, 400. Aggiungere 100 µ l di ciascuna diluizione ai pozzetti e lasciare per incubare per 2 ore a temperatura ambiente. Rimuovere il siero da ogni pozzetto e lavare con 0,2 mL di PBS-T tre volte. Incubare ogni bene con 0,1 mL di anticorpo di IgG anti-llama capra HRP-coniugato ad una diluizione di 1: 20,000 per 1 h.Nota: La risposta immunitaria misurata include entrambi convenzionali così come catene pesanti soli anticorpi, che sono presenti in proporzioni approssimativamente uguali in circolazione3,14. Rimuovere la soluzione di anticorpo e lavare ogni bene con 0,2 mL di PBS-T tre volte. Aggiungere 100 µ l di substrato cromogenico perossidasi nel pozzetto e incubare a temperatura ambiente fino a quando l’intensità dei due punti più alti di concentrazione hanno diventare saturi, che prende di solito 5-10 min. Aggiungere 100 µ l di acido solforico 0,1 M a ciascun pozzetto per arrestare la reazione. Misurare l’assorbanza di ciascun pozzetto a 450 nm utilizzando un lettore di piastra. Tracciare l’assorbanza come una concentrazione di funzione. Complicazioni potenziali e di monitoraggio di Alpaca Garantire alpaca appropriato monitoraggio durante tutta la procedura.Nota: Le procedure non dovrebbero causare effetti avversi significativi. Salute e benessere degli animali devono essere monitorati quotidianamente da allevamento e/o ricerca personale durante l’alimentazione e l’abbeveraggio. Qualsiasi animale con unalleviated sperimentalmente indotto o spontaneo naturale morbosità deve essere denunciati per la valutazione di servizi veterinari con trattamenti forniti a seconda dei casi, fino a humane eutanasia, se necessario.Potenziali conseguenze negative associate a flebotomia sono sanguinamento, ecchimosi ed ematoma. Gli animali devono essere monitorati per 20 min post prelievo di sangue cercare segni di sanguinamento. Ulteriori pressioni sui siti dovrebbero essere usato. Se il sanguinamento non si ferma, un veterinario deve essere contattato.Altre potenziali conseguenze negative associate con iniezioni e sanguinamento includono infiammazione e formazione di granuloma. Formazione del granuloma non è previsto e non è stato osservato presso l’Università del Kentucky. L’infiammazione del sito di iniezione (arrossamento o gonfiore) potrebbe verificarsi e dovrebbe essere portato all’attenzione di un veterinario. L’emorragia di produzione rappresenta un volume di sangue potenzialmente importanti, e gli animali devono essere monitorati per assicurare che sono stabili e attivi dopo la raccolta del sangue.Anafilassi e pirogene risposte sono le due più probabili gravi conseguenze negative, ma sono osservate molto raramente. Se dovesse verificarsi, anafilassi si verificano poco dopo le iniezioni di antigene e manifestarsi con un aumento della temperatura rettale, debolezza, vomito, problemi respiratori, o diarrea. Temperatura rettale può essere monitorata dopo ogni iniezione per rilevare eventuali aumenti della temperatura corporea. Se questi sono riconosciuti, notificare un veterinario immediatamente per una consultazione. Inoltre, un “Crash Kit di emergenza” (ad es., adrenalina, corticosteroidi e antistaminico) elaborata in consultazione con un veterinario dovrebbe essere disponibile a curare gli animali ritenuti sospettati di avere una reazione avversa. 2. purificazione di linfociti per singolo dominio anticorpo costruzione della libreria Raccogliere 50 mL di sangue tre-cinque giorni dopo l’ultima iniezione (Vedi punto 1.4).Nota: Elaborazione rapida di sangue e l’isolamento di RNA è importante ottenere una libreria adatta dimensioni15,3, che è molto importante per il successo di panning. Diluire 15 mL di sangue prelevato con 5 mL di PBS. Utilizzare un tubo di separazione del linfocita per isolare i linfociti periferici del sangue (PBLs) mediante centrifugazione in gradiente di densità in base ai suggerimenti di produce.Attenzione: Le istruzioni del produttore indicano che fino a 25 mL di sangue può essere utilizzato, ma questo può saturare il sistema e impedire di ottenere una preparazione pulita del linfocita. Aggiungere 5 mL di PBS prechilled a 4 ° C di PBL. Girare per 20 min a 800 x g a 4 ° C. Lavare due volte con l’aggiunta di 5 mL di PBS prechilled a 4 ° C a PBL seguita da centrifugazione per 20 min a 800 x g a 4 ° C. Isolare gli RNA totale usando un sistema di rotazione-colonna basata, secondo le istruzioni del produttore. Omogeneizzare le cellule mediante dispositivi nel buffer appropriato e applicazione a un sistema di triturazione di biopolimero. Utilizzare un numero adeguato di mini o maxi-colonne in base alla cella di input. Sintetizzare cDNA usando il transcriptase combinando 10 µ g di RNA con un mix di 0.1 µ g di Oligo (dT) primers di 12-18. Generare una libreria di batteriofago utilizzando metodi stabiliti4. Si tratta di clonazione con enzimi di restrizione nel phage display vettoriale pMES4 seguito dall’espressione dell’inserto fusa al gene III del fago filamentoso per la produzione della soluzione dei fagi. 3. singolo dominio anticorpo Panning Prodotti antigene affinità piastre con superficie trattata piastre da 96 pozzetti. Diluire 0,25 µ g dell’antigene in tampone carbonato di sodio di 100 mM, pH 9.0. Aggiungere 100 µ l di questa soluzione in ogni pozzetto e incubare per una notte a 4 ° C. Cappotto due pozzi per l’antigene. Preparare un controllo vuoto ben che è rivestito con tampone di carbonato solo.Nota: Piastre possono essere prodotto e immagazzinati per fino a una settimana a 4 ° C se più cicli di selezione verranno eseguite. Inoltre, questo metodo utilizza assorbimento diretto che non richiede etichettatura mentre altri metodi utilizzano biotinylation o altri tipi di strategie di etichettatura. Incubare la piastra durante la notte. Inverti per rimuovere il contenuto dei pozzetti e lavare tre volte con 0,1 mL di PBS-T. Bloccare i pozzetti aggiungendo 0,1 mL di BSA (20 mg/mL) in PBS e incubare la piastra per 2 h a temperatura ambiente. Lavare la piastra tre volte con PBS-T seguita da tre volte con PBS. Antigeni possono essere anche covalentemente etichettati e utilizzati nei sistemi di cattura come, ad esempio, sistemi di streptavidina/biotina. Pre-trattare la soluzione dei fagi (100 µ l) con 100 µ l di 40 mg/mL BSA in PBS su una pedana vibrante a temperatura ambiente per 30 min. Aggiungere la soluzione di fago all’antigene pozzetti rivestiti con e incubare con movimentazione delicata per 2 h a temperatura ambiente. Utilizzare pozzi multipli al fine di garantire un totale di 1011 dei fagi per ogni antigene. Scartare il fago non associato di inversione e quindi lavare i pozzetti 5 volte con 200 µ l di PBS-T seguita da cinque volte con PBS. Eluire il fago associato aggiungendo 0,1 mL di tripsina 0,25 mg/mL in PBS e incubare per 30 min a temperatura ambiente sulla piattaforma vibra a 700 rpm. Trasferire la soluzione in un flaconcino contenente 5 µ l di soluzione di hydrochloride(AEBSF) di 4 mg/mL 4-benzenesulfonyl fluoruro per placare l’attività della tripsina. Crescere a 37 ° C con agitazione fino OD600 le celle competenti TG1 phage display = 0,5. Aggiungere 50 µ l del fago eluito a 3 mL di cellule del TG1. Incubare a 37 ° C senza agitare per 30 min. Aggiungere 7 mL di LB media completati con ampicillina di 100 µ g/mL, 2% di glucosio. Agitare una notte a 37 ° C.Nota: Per ottenere i più diversi anticorpi di singolo dominio, cloni possono essere sequenziati, testati per proprietà desiderate e utilizzati dopo il primo turno di panning. Per ottenere la più alta affinità degli anticorpi di singolo dominio, dovrebbero essere utilizzati due turni di panning. Piastra i batteri dopo la crescita durante la notte su piastre di agar LB completati con ampicillina di 100 µ g/mL, 2% di glucosio. Diluizioni seriali diversi dovrà essere testato, a partire con due diluizioni, placcatura 100 µ l di 1/10.000 e 1/100.000 diluizioni. Incubare la piastra durante la notte a 37 ° C. Scegli le colonie e inoculare i pozzetti di una piastra a 96 pozzetti sterile contenenti 100 µ l di 2XYT con 100 µ g/mL ampicillina, 2% di glucosio, glicerolo 10% v/v per pozzetto. Incubare per una notte a 37 ° C senza agitazione. Il giorno successivo, agitare a 170 giri/min a 37 ° C per 60 min. Rimuovere 2 µ l di media in provette per PCR. La soluzione rimanente può essere lasciata nel piatto e conservata a 4 ° C per 1-2 giorni o congelata e conservata a-80 ° C per un uso successivo. Eseguire la reazione di PCR utilizzando primers appropriato per il vettore utilizzato. Per pMES4, lo screening di PCR dei cloni positivi usi primer che fiancheggiano i polylinker è CCTATTGCCTACGGCAGCCGCTGGATTGTTATTAC e GGTGGTGTGAGGAGACGGTGACCTG. Utilizzare ciclismo condizioni appropriate per la polimerasi utilizzata, una temperatura di annealing di 57 ° C e 30 cicli. Analizzare la reazione di PCR mediante l’esecuzione di un gel di agarosio 1% (p/v). Colonie che sono positivi hanno dominio singolo anticorpo gene inserti di ~ 500 BP. Accertarsi che i cloni positivi sono 20-50% del campione.Nota: Questo metodo fornisce un mezzo per clone, selezione e analisi che possono essere eseguite nella maggior parte dei laboratori di ricerca. In alternativa, sequenziamento di nuova generazione possa essere applicato e fornisce grandi set di dati che consentono l’analisi statistica e comparativa16. Inoculare i cloni positivi dalla piastra in fresche provette contenenti 7 mL di LB con ampicillina di 100 µ g/mL. Crescere con l’agitazione per una notte a 37 ° C. Eseguire un miniprep sulla cultura per ottenere il DNA del plasmide. Sequenza di cloni positivi utilizzando lo standard di sequenziamento primer pEX-Rev (CAGGCTTTACACTTTATGCTTCCGGC). Eseguire analisi computazionale sulle sequenze di anticorpo risultante singolo dominio. Assicurarsi che non ci sono nessun codoni di stop o telaio si sposta. Classificare le sequenze risultanti per somiglianza e diversità. Le sequenze che vengono ripetutamente identificate sono più probabile di essere sequenze di legame ad alta affinità, particolarmente dopo due turni di selezione. Esprimere l’anticorpo di singolo dominio utilizzando un ceppo BL21-derivato espressione di E. bobina. Indurre l’espressione attraverso l’aggiunta di IPTG, crescendo durante la notte a 22 ° C. Purificare l’anticorpo di singolo dominio mediante cromatografia di affinità immobilizzata di metallo (IMAC). Convalidare l’associazione di anticorpi e antigeni di singolo dominio usando un’analisi di interazione diretta come l’elettroforesi del gel di pull-down, nativo, o ELISA. Verificare le prestazioni di anticorpo specifico dell’applicazione singolo dominio, come desiderato per l’esperimento specifico.