Isolation de F₁-ATPase de la protiste parasite Trypanosoma brucei

Les type F ATP synthases sont membranaires tournantes complexes multiprotéiques que la translocation de protons couple à travers les membranes transduction de l’énergie des bactéries, des mitochondries et chloroplastes avec la formation d’ATP. Les détails moléculaires du mécanisme de rotation de la synthèse d’ATP sont connus principalement en raison des études structurales de purifiée bactérienne et mitochondrial ATP synthases et leurs subcomplexes¹. F-type ATP synthase est organisé dans les fractions membranaires intrinsèques et extrinsèques à la membrane. La partie membranaire-extrinsèque, appelée F₁-ATPase, contient trois sites catalytiques, où la phosphorylation de l’adénosine diphosphate (ADP) à ATP ou la réaction inverse se produit. F₁-ATPase peut être libéré expérimentalement la portion membranaires intrinsèques tout en conservant sa capacité à hydrolyser, mais pas synthétiser, ATP. Le secteur de membrane-bondissent, dénommé F_o, intervient dans la translocation de la protéine, qui entraîne la rotation de la partie centrale de l’enzyme. Les secteurs de_o F et de F₁ sont reliés par des tiges centrales et périphériques.

La première tente de purifier le F₁-ATPase de la levure de bière et de la date de mitochondries de coeur de boeuf vers les années 1960. Ces protocoles utilisés extraites des mitochondries, qui ont été perturbées par la sonication, fractionnée par précipitation au sulfate d’ammonium ou de protamine, suivie par chromatographie facultatif étapes et traitement thermique^{2,3,4 ,5,6}. La purification a été grandement améliorée et simplifiée par l’utilisation du chloroforme, qui libère facilement le F₁-ATPase de la membrane mitochondriale des fragments⁷. L’extraction de chloroforme a ensuite été utilisée pour extraire des F₁– ATPases de divers animaux, végétaux et des sources bactériennes (p. ex., foie de rat⁸, maïs⁹, Arum maculatum¹⁰et Escherichia coli ¹¹). Outre la purification du chloroforme-sortie F₁-ATPase par chromatographie d’affinité ou exclusion stérique (SEC) a produit une protéine pure hautement complexe, qui convenait pour la détermination de la structure à haute résolution par cristallographie aux rayons x, comme documenté par les structures de F₁-ATPase de coeur bovine^12,13 et¹⁴de la Saccharomyces cerevisiae. F₁-ATPase structures ont été également déterminées d’organismes qui sont difficiles à cultiver et, par conséquent, la quantité de la matière biologique initiale était limitée. Dans ce cas, le F₁-ATPase sous-unités ont été artificiellement exprimées et assemblées dans le complexe chez e. coli, et l’ensemble hétérologue enzyme a été purifiée par affinité Chromatographie via une sous-unité étiquetée. Cette approche a conduit à la détermination de F₁-structures de l’ATPase de deux espèces de bactéries thermophiles, Geobacillus stearothermophilus¹⁵ et thermarum Caldalkalibacillus^{16, 17}. Toutefois, cette méthode est plutôt impropre à eucaryotes F₁– ATPases puisqu’elle s’appuie sur l’appareil protheosynthetic procaryote, transformation post-traductionnelle et assemblage complexe.

L’extraction axée sur le chloroforme a été précédemment utilisée pour isoler F₁– ATPases de digène unicellulaires parasites Trypanosoma cruzi¹⁸ et T. brucei¹⁹, importants pathogènes chez les mammifères d’Amérique et Les trypanosomiases africaines, respectivement et de monogénique insecte parasite Crithidia fasciculata²⁰. Ces purifications conduit seulement à une simple description de la F₁– ATPases, puisqu’aucune demande en aval ont été utilisées pour caractériser complètement la composition, structure et propriétés enzymatiques du complexe. Cet article décrit une méthode optimisée pour F₁-purification de l’ATPase de l’étape de cycle de vie insectes cultivées de T. brucei. La méthode est élaborée selon les protocoles établis pour l’isolement de bovins et la levure F₁– ATPases^21,22. La procédure donne très pure et homogène enzyme appropriée pour in vitro enzymatiques et inhibiteur des dosages, protéomiques détaillées caractérisation par spectrométrie de masse²³et de détermination de structure²⁴. Le protocole de purification et de la connaissance de la F₁-structure de l’ATPase au niveau atomique ouvre une possibilité pour la conception d’écrans pour identifier les inhibiteurs de petites molécules et aider au développement de nouveaux médicaments contre les trypanosomiases africaines. En outre, le protocole peut être adapté pour purifier F₁-ATPase provenant d’autres organismes.