عزل و1-ATPase من "طلائعيات طفيلية" المثقبيات البروسية
Summary
يصف هذا البروتوكول تنقية إف1-ATPase من مرحلة الحشرات مثقف المثقبيات البروسية. الإجراء غلة معقدة جداً نقية ومتجانسة ونشط مناسبة لدراسات هيكلية والانزيميه.
Abstract
إف1-ATPase هو سوبكومبليكس حفاز الأغشية خارجية من نوع F ATP synthase، إنزيم يستخدم القوة الدافعة بروتون عبر الأغشية البيولوجية لإنتاج أدينوسين ثلاثي الفوسفات (ATP). عزل و سليمة1-ATPase من مصدرها الأصلي شرط أساسي لتحديد خصائص تكوين البروتين ومعلمات الحركية حساسية لمثبطات للانزيم. نقية للغاية ومتجانسة و1-يمكن استخدام أتباسي للدراسات الهيكلية، التي توفر نظرة ثاقبة الآليات الجزيئية لتوليف ATP والتحلل المائي. توضح هذه المقالة إجراء لتنقية و1-ATPase من المثقبيات البروسية، المسبّب تريبانوسومياسيس الأفريقية. و1-ATPase يتم عزل من الحويصلات الميتوكوندريا، التي يتم الحصول عليها من تفسخ ناقص التوتر من المثقبيات في المختبر مثقف. ميكانيكيا مجزأة الحويصلات sonication واف1-ATPase يتم تحريرها من غشاء الميتوكوندريا الداخلية باستخراج كلوروفورم. كذلك هو تنقية المجمع الانزيمية بتبادل شاردة متتالية وحجم الاستبعاد اللوني. التقنيات الحساسة الكتلي أظهر أن المجمع المنقي خاليا من أي ملوثات البروتين، ولذلك يمثل مادة مناسبة لتحديد بنية البلورات بالأشعة السينية أو المجهر الإلكتروني cryo. و معزولة1-ATPase معارض النشاط هيدروليكي ATP، التي يمكن أن تحول دون تماما بأزيد الصوديوم، مثبط قوية من ATP و من نوع سينثاسيس. ويظل المجمع المنقي مستقرة ونشطة لمدة ثلاثة أيام على الأقل في درجة حرارة الغرفة. هطول الأمطار بسلفات الأمونيوم يستخدم للتخزين على المدى الطويل. وقد استخدمت إجراءات مماثلة لتنقية و1-أتباسيس من أنسجة الثدييات والنباتات، والخمائر، أو البكتيريا. وهكذا، يمكن أن تخدم البروتوكول المقدم كمبدأ توجيهي لل و1-ATPase في معزل عن غيرها من الكائنات.
Introduction
سينثاسيس و من نوع ATP الملازمين للغشاء تناوب مجمعات مولتيبروتين إزفاء بروتون أن الزوجين عبر أغشية ترانسدوسينج الطاقة من البكتيريا، الميتوكوندريا، والمعايشة مع تشكيل ATP. التفاصيل الجزيئية إليه التناوب من التوليف ATP معروفة أساسا بسبب الدراسات الهيكلية لتنقية البكتيرية والمتقدريه ATP سينثاسيس و سوبكومبليكسيس1. ونوع ATP synthase ينقسم إلى مويتيس غشاء الجوهرية والأغشية الخارجية. الجزء الأغشية الخارجية، المعروفة باسم إف1-ATPase، يحتوي على ثلاثة مواقع الحفاز، حيث تحدث الفسفرة diphosphate الأدينوزين (ADP) إلى ATP أو رد فعل عكسي. إف1-يمكن إصدار ATPase تجريبيا من مجموعة الأغشية الغير مضمنة مع احتفاظها بقدرتها على يتحلل، لكن لا توليف، ATP. قطاع غشاء زمنياً، تسمى وo، يتوسط إزفاء البروتين، مما يدفع تناوب الجزء المركزي من الإنزيم. و1 و Fo قطاعات متصلة بواسطة سيقان المركزية والطرفية.
الأول محاولات لتنقية و1-ATPase من الخميرة مهدها والقلب البقري الميتوكوندريا تاريخ العودة إلى الستينات. استخراج هذه البروتوكولات تستخدم الميتوكوندريا، التي تعطلت بفعل سونيكيشن، مجزأ بترسيب كبريتات الأمونيوم أو البروتامين، متبوعاً بدرجات اللوني الاختياري والمعالجة بالحرارة2،3،4 ،،من56. التنقية تحسنت إلى حد كبير والمبسطة باستخدام كلوروفورم، مما يسهل النشرات و1-ATPase من غشاء الميتوكوندريا شظايا7. استخراج كلوروفورم ثم استخدم لاستخراج و1-أتباسيس من مختلف الحيوانات والنباتات ومصادر البكتيرية (مثلاً، الجرذ الكبد8، الذرة9 والابقع قلقاس10و الإشريكيّة القولونية 11). المزيد من تنقية صدر كلوروفورم و1-ATPase التي تقارب أو حجم الاستبعاد اللوني (SEC) أسفرت عن بروتين عالية نقية معقدة، التي كانت مناسبة لتصميم هيكل عالي الاستبانة بعلم البلورات بالأشعة السينية، كما موثقة من قبل هياكل إف1-ATPase من القلب البقري12،13 و14من Saccharomyces cerevisiae. إف1-هياكل ATPase وحددت أيضا من الكائنات الحية التي يصعب زراعتها، وهكذا، كانت كمية المواد البيولوجية الأولية محدودة. في هذه الحالة، و1-أعرب عن مفارز ATPase وتجميعها في المجمع في كولايمصطنع، وتمت تنقية الإنزيم مغايرة كلياً بالتقارب اللوني عن طريق وحدة فرعية للمعلمة. مثل هذا النهج أدى إلى تحديد و1-هياكل ATPase من نوعين من أنواع البكتيريا لاسخدام، ستيروثيرموفيلوس جيوباسيلوس15 و16 ثيرماروم كالدالكاليباسيلوس، 17. ومع ذلك، هذه المنهجية غير مناسب بدلاً من التوكسينات و1-أتباسيس حيث أنها تعتمد على جهاز بروثيوسينثيتيك بدائية والتجهيز بوستترانسلاشونال، والجمعية المعقدة.
استخراج كلوروفورم القائم كان يستخدم لعزل و1-أتباسيس من ثنائيهالعائل أحادي الخلية الطفيليات مثقبيه الكروزية18 والبروسية ت.19، أهمية العوامل الممرضة الثدييات مما تسبب في أمريكا و تريبانوسومياسيس الأفريقية، على التوالي، ومن الطفيليات الحشرات مونوجينيك فاسسيكولاتا كريثيديا20. تنقية هذه أدت فقط إلى وصف بسيط و1-أتباسيس، حيث استخدمت أية تطبيقات المصب تماما وصف تكوين وهيكل، وخصائص الانزيمية للمجمع. توضح هذه المقالة أسلوب أمثل إف1-تنقية ATPase من مرحلة دورة حياة الحشرات مثقف البروسية ت. الأسلوب هو وضعت استناداً إلى البروتوكولات المعمول بها لعزل الأبقار والخميرة و1-أتباسيس،من2122. الإجراء غلة عالية نقية ومتجانسة توصيف مفصل البروتين الكتلي23، و تصميم هيكل24إنزيم مناسب في المختبر الانزيمية والمثبطة فحوصات،. البروتوكول تنقية والمعرفة و1-هيكل ATPase على المستوى الذري يفتح إمكانية تصميم شاشات لتحديد مثبطات جزيء صغير، والمساعدة في تطوير عقاقير جديدة ضد تريبانوسومياسيس الأفريقية. وعلاوة على ذلك، البروتوكول يمكن تكييفها لتنقية و1-ATPase من الكائنات الحية الأخرى.
Protocol
Representative Results
Discussion
بروتوكول إف1-تنقية ATPase من البروسية ت. وقد وضعت استناداً إلى أساليب نشرها مسبقاً لعزل و1-مجمعات ATPase من13،الأنواع الأخرى14. الأسلوب لا يتطلب أي التعديل الوراثي (مثلاً، وضع علامات) وينتج مجمع نشط بشكل كامل مع جميع الوحدات الفرعية الحالية. ال?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
تم تمويل هذا العمل من قبل وزارة “التعليم منسق الإغاثة الطارئة تشيكوسلوفاكيا” منح LL1205، منحة “وكالة المنح من الجمهورية التشيكية” 18-17529S، والتي سيطلب/كلية العلوم التربوية مشروع مركز البحوث الإمراضية وضراوة الطفيليات (رقم CZ.02.1.01/0.0/0.0/16_019/0000759).
Materials
| Chemicals | |||
| Adenosin Diphosphate Disodium Salt (ADP) | Applichem | A0948 | |
| Amastatin Hydrochloride | Glantham Life Sciences | GA1330 | |
| Aminocaproic Acid | Applichem | A2266 | |
| BCA Protein Assay Kit | ThermoFischer Scientific/Pierce | 23225 | |
| Benzamidine Hydrochloride | Calbiochem | 199001 | |
| Bestatin Hydrochloride | Sigma Aldrich/Merck | B8385 | |
| Chloroform | Any supplier | ||
| cOmplete Tablets, Mini EDTA-free | Roche | 4693159001 | Protease inhibitor cocktail tablets |
| Ethylenediaminetetraacetic Acid (EDTA) | Any supplier | ||
| Hydrochloric Acid | Any supplier | For pH adjustment | |
| Ile-Pro-Ile | Sigma Aldrich/Merck | I9759 | Alias Diprotin A |
| Leupeptin | Sigma Aldrich/Merck | L2884 | |
| Magnesium Sulfate Heptahydrate | Any supplier | ||
| Pepstatin A | Sigma Aldrich/Merck | P5318 | |
| Protein Electrophoresis System | Any supplier | ||
| Sodium Chloride | Any supplier | ||
| Sucrose | Any supplier | ||
| Tris | Any supplier | ||
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Consumables | |||
| Centrifuge Tubes for SW60Ti, Polyallomer | Beckman Coulture | 328874 | |
| DounceTissues Homogenizer 2 mL | Any supplier | ||
| Glass Vacuum Filtration Device | Sartorius | 516-7017 | Degasing solutions for liquid chromatography |
| HiTrap Q HP, 5 mL | GE Healthcare Life Sciences | 17115401 | Anion exchange chromatography column |
| Regenaretad Cellulose Membrane Filters, pore size 0.45 μm, diameter 47 mm | Sartorius | 18406–47——N | Degasing solutions for liquid chromatography |
| Superdex 200 Increase 10/300 GL | GE Healthcare Life Sciences | 29091596 | Size-exclusion chromatography column |
| Vivaspin 6 MWCO 100 kDa PES | Sartorius | VS0641 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Equipment | |||
| AKTA Pure 25 | GE Healthcare Life Sciences | 29018224 | Or similar FPLC system |
| Spectrophotometer Shimadzu UV-1601 | Shimadzu | Or similar spectrophotometer with kinetic assay mode | |
| Ultracentrifuge Beckman Optima with SW60Ti Rotor | Beckman Coulture | Or similar ultracentrifuge and rotor | |
| Ultrasonic Homogenizer with Thin Probe, Model 3000 | BioLogics | 0-127-0001 | Or similar ultrasonic homogenizer |
References
- Walker, J. E., Wikström, M. Structure, mechanism and regulation of ATP synthases. Mechanisms of Primary Energy Transduction in Biology. , 338-373 (2017).
- Pullman, M. E., Penefsky, H. S., Datta, A., Racker, E. Partial resolution of the enzymes catalyzing oxidative phosphorylation. I. Purification and properties of soluble dinitrophenol-stimulated adenosine triphosphatase. The Journal of Biological Chemistry. 235, 3322-3329 (1960).
- Schatz, G., Penefsky, H. S., Racker, E. Partial resolution of the enzymes catalyzing oxidative phosphorylation. XIV. The Journal of Biological Chemistry. 242 (10), 2552-2560 (1967).
- Racker, E., Horstman, L. L. Partial resolution of the enzymes catalyzing oxidative phosphorylation. 13. Structure and function of submitochondrial particles completely resolved with respect to coupling factor. The Journal of Biological Chemistry. 242 (10), 2547-2551 (1967).
- Senior, A. E., Brooks, J. C. Studies on the mitochondrial oligomycin-insensitive ATPase. I. An improved method of purification and the behavior of the enzyme in solutions of various depolymerizing agents. Archives of Biochemistry and Biophysics. 140 (1), 257-266 (1970).
- Tzagoloff, A., Meagher, P. Assembly of the mitochondrial membrane system. V. Properties of a dispersed preparation of the rutamycin-sensitive adenosine triphosphatase of yeast mitochondria. The Journal of Biological Chemistry. 246 (23), 7328-7336 (1971).
- Beechey, R. B., Hubbard, S. A., Linnett, P. E., Mitchell, A. D., Munn, E. A. A simple and rapid method for the preparation of adenosine triphosphatase from submitochondrial particles. Biochemical Journal. 148 (3), 533-537 (1975).
- Tyler, D. D., Webb, P. R. Purification and properties of the adenosine triphosphatase released from the liver mitochondrial membrane by chloroform. Biochemical Journal. 178 (2), 289-297 (1979).
- Hack, E., Leaver, C. J. The alpha-subunit of the maize F1-ATPase is synthesised in the mitochondrion. The EMBO Journal. 2 (10), 1783-1789 (1983).
- Dunn, P. P., Slabas, A. R., Moore, A. L. Purification of F1-ATPase from cuckoo-pint (Arum maculatum) mitochondria. A comparison of subunit composition with that of rat liver F1-ATPase. Biochemical Journal. 225 (3), 821-824 (1985).
- Satre, M., Bof, M., Vignais, P. V. Interaction of Escherichia coli adenosine triphosphatase with aurovertin and citreoviridin: inhibition and fluorescence studies. Journal of Bacteriology. 142 (3), 768-776 (1980).
- Abrahams, J. P., Leslie, A. G., Lutter, R., Walker, J. E. Structure at 2.8 Å resolution of F1ATPase from bovine heart mitochondria. Nature. 370 (6491), 621-628 (1994).
- Lutter, R., et al. Crystallization of F1-ATPase from bovine heart mitochondria. Journal of Molecular Biology. 229 (3), 787-790 (1993).
- Kabaleeswaran, V., Puri, N., Walker, J. E., Leslie, A. G., Mueller, D. M. Novel features of the rotary catalytic mechanism revealed in the structure of yeast F1-ATPase. The EMBO Journal. 25 (22), 5433-5442 (2006).
- Shirakihara, Y., et al. Structure of a thermophilic F1-ATPase inhibited by an epsilon-subunit: deeper insight into the epsilon-inhibition mechanism. The FEBS Journal. 282 (15), 2895-2913 (2015).
- Stocker, A., Keis, S., Cook, G. M., Dimroth, P. Purification, crystallization, and properties of F1-ATPase complexes from the thermoalkaliphilic Bacillus sp. strain TA2.A1. Journal of Structural Biology. 152 (2), 140-145 (2005).
- Ferguson, S. A., Cook, G. M., Montgomery, M. G., Leslie, A. G., Walker, J. E. Regulation of the thermoalkaliphilic F1-ATPase from Caldalkalibacillus thermarum. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (39), 10860-10865 (2016).
- Cataldi de Flombaum, M. A., Frasch, A. C. C., Stoppani, A. O. M. Adenosine triphosphatase from Trypanosoma cruzi: purification and properties. Comparative Biochemistry and Physiology Part B: Comparative Biochemistry. 65 (1), 103-109 (1980).
- Williams, N., Frank, P. H. The mitochondrial ATP synthase of Trypanosoma brucei: isolation and characterization of the intact F1 moiety. Molecular and Biochemical Parasitology. 43 (1), 125-132 (1990).
- Higa, A. I., Cazzulo, J. J. Mg2+-activated adenosine triphosphatase from Crithidia fasciculata: purification and inhibition by suramin and efrapeptin. Molecular and Biochemical Parasitology. 3 (6), 357-367 (1981).
- Walker, J. E., et al. Primary structure and subunit stoichiometry of F1-ATPase from bovine mitochondria. Journal of Molecular Biology. 184 (4), 677-701 (1985).
- Mueller, D. M., et al. Ni-chelate-affinity purification and crystallization of the yeast mitochondrial F1-ATPase. Protein Expression and Purification. 37 (2), 479-485 (2004).
- Gahura, O., et al. The F1-ATPase from Trypanosoma brucei is elaborated by three copies of an additional p18-subunit. The FEBS Journal. 285 (3), 614-628 (2018).
- Montgomery, M. G., Gahura, O., Leslie, A. G. W., Zikova, A., Walker, J. E. ATP synthase from Trypanosoma brucei has an elaborated canonical F1-domain and conventional catalytic sites. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 115 (9), 2102-2107 (2018).
- Schneider, A., Charriere, F., Pusnik, M., Horn, E. K. Isolation of mitochondria from procyclic Trypanosoma brucei. Methods in Molecular Biology. 372, 67-80 (2007).
- Smith, P. K., et al. Measurement of protein using bicinchoninic acid. Analytical Biochemistry. 150 (1), 76-85 (1985).
- Wirtz, E., Leal, S., Ochatt, C., Cross, G. A. A tightly regulated inducible expression system for conditional gene knock-outs and dominant-negative genetics in Trypanosoma brucei. Molecular and Biochemical Parasitology. 99 (1), 89-101 (1999).
- Speijer, D., et al. Characterization of the respiratory chain from cultured Crithidia fasciculata. Molecular and Biochemical Parasitology. 85 (2), 171-186 (1997).
- Nelson, R. E., Aphasizheva, I., Falick, A. M., Nebohacova, M., Simpson, L. The I-complex in Leishmania tarentolae is an uniquely-structured F1-ATPase. Molecular and Biochemical Parasitology. 135 (2), 221-224 (2004).
- Carbajo, R. J., et al. How the N-terminal domain of the OSCP subunit of bovine F1Fo-ATP synthase interacts with the N-terminal region of an alpha subunit. Journal of Molecular Biology. 368 (2), 310-318 (2007).
- Bowler, M. W., Montgomery, M. G., Leslie, A. G., Walker, J. E. Ground state structure of F1-ATPase from bovine heart mitochondria at 1.9 Å resolution. The Journal of Biological Chemistry. 282 (19), 14238-14242 (2007).
