Questo protocollo descrive la purificazione di F1-ATPase dal palco dell’insetto colta di Trypanosoma brucei. La procedura produce un complesso altamente puro, omogeneo e attivo adatto per studi strutturali ed enzimatici.
F1-atpasi è una membrana-estrinseca ossidrilasico catalitica del F-tipo ATP sintasi, un enzima che utilizza la forza motrice protonica attraverso le membrane biologiche per la produzione di adenosina trifosfato (ATP). L’isolamento del intatta F1-ATPasi dalla sorgente nativo è un prerequisito essenziale per caratterizzare la composizione proteica, parametri cinetici e sensibilità agli inibitori dell’enzima. Un altamente puro e omogeneo F1-ATPasi possono essere utilizzato per studi strutturali, che forniscono la comprensione nei meccanismi molecolari di sintesi di ATP e idrolisi. In questo articolo viene descritta una procedura per la purificazione del F1-ATPase dal Trypanosoma brucei, l’agente causativo di trypanosomiases africano. F1-atpasi è isolato dalle vescicole mitocondriale, che sono ottenute da Lisi ipotonica da in vitro coltivate trypanosomes. Le vescicole sono frammentate meccanicamente di sonicazione e la F1-ATPasi viene rilasciato dalla membrana mitocondriale interna mediante l’estrazione di cloroformio. Il complesso enzimatico viene ulteriormente purificato di scambio anionico consecutivi e la cromatografia di esclusione dimensionale. Tecniche di spettrometria di massa sensibile ha mostrato che il complesso purificato è privo di contaminanti virtualmente qualsiasi proteina e, pertanto, rappresenta il materiale adatto per la determinazione della struttura di cristallografia a raggi x o cryo-microscopia elettronica. L’isolato F1-ATPasi esibisce attività idrolitica di ATP, che può essere inibito completamente da sodio azide, un potente inibitore delle F-tipo ATP sintasi. Il complesso purificato rimane stabile e attiva per almeno tre giorni a temperatura ambiente. Precipitazione con solfato di ammonio è usato per immagazzinaggio a lungo termine. Procedure simili sono state usate per la purificazione di F1– atpasi da tessuti di mammiferi e vegetali, lieviti o batteri. Così, il protocollo presentato può servire come guida per la F1-isolamento dell’atpasi da altri organismi.
I tipo F ATP sintasi sono membrana-limitano rotanti complessi multiproteici tale traslocazione del protone di coppia attraverso le membrane trasduzione di energia dei batteri, i mitocondri e cloroplasti con la formazione di ATP. Dettagli molecolari del meccanismo di rotazione di sintesi di ATP sono noti principalmente a causa di studi strutturali di purificato batterica e mitocondriale ATP sintasi e loro subcomplexes1. F-tipo trifosfato di adenosina synthase è organizzato in membrana-intrinseche ed estrinseche-membrana moiety. Parte della membrana-estrinseco, nota come F1-atpasi, contiene tre siti catalitici, dove si verifica la fosforilazione dell’adenosina difosfato (ADP) di ATP o la reazione inversa. F1-ATPasi possono essere rilasciato sperimentalmente da parte dell’intrinseca di membrana pur mantenendo la sua capacità di idrolizzare, ma non sintetizzare, ATP. Il settore di membrana-limita, chiamato Fo, media la traslocazione di proteine, che aziona la rotazione della parte centrale dell’enzima. La F1 e Fo settori sono collegati da steli centrali e periferici.
I primi tentativi di purificare la F1-atpasi da lievito e cuore bovino mitocondri data indietro al 1960. Questi protocolli utilizzati estratti di mitocondri, che sono stati interrotti di sonicazione, frazionato da precipitazione del solfato dell’ammonio o protamina, seguita da cromatografia opzionale passo (s) e trattamento termico2,3,4 ,5,6. La purificazione è stato notevolmente migliorata e semplificata mediante l’uso di cloroformio, che prontamente rilascia la F1-ATPasi dalla membrana mitocondriale frammenti7. L’estrazione di cloroformio è stato poi utilizzato per estrarre F1– atpasi da vari animali, vegetali e fonti batteriche (ad es., del fegato del ratto8, mais9, Arum maculatum10e Escherichia coli 11). Ulteriore purificazione del cloroformio-rilasciato F1-ATPasi mediante cromatografia di affinità o di esclusione (SEC) ha reso una proteina altamente pura complessa, che era adatta per la determinazione della struttura ad alta risoluzione di cristallografia a raggi x, come documentato dalle strutture di F1-atpasi da cuore bovino12,13 e14di Saccharomyces cerevisiae. F1-strutture dell’atpasi inoltre sono stati determinati da organismi che sono difficili da coltivare e, quindi, la quantità di materiale biologico iniziale era limitata. In questo caso, la F1-subunità ATPasi sono stati artificialmente espresso e assemblate per formare il complesso dentro e. colie l’enzima intero eterologa è stato purificato mediante cromatografia affinità tramite una subunità taggata. Tale approccio ha portato alla determinazione di F1-strutture di atpasi da due specie di batteri termofile, Geobacillus stearothermophilus15 e thermarum Caldalkalibacillus16, 17. Tuttavia, questa metodologia è piuttosto inadatta per eucariotica F1– ATPasi dato che si basa sull’apparato protheosynthetic procariote, elaborazione post-traduzionale e assiemi complessi.
L’estrazione basata su cloroformio utilizzato in precedenza per isolare F1– atpasi da unicellulari digenetic parassiti Trypanosoma cruzi18 e T. brucei19, importanti patogeni mammiferi causando americano e Trypanosomiases africano, rispettivamente e da malattie monogenica insetto parassita Crithidia fasciculata20. Queste purificazioni ha condotto soltanto a una semplice descrizione del F1– atpasi, poiché nessuna applicazione a valle sono stata usata per caratterizzare la composizione, struttura e proprietà enzimatiche del complesso. Questo articolo viene descritto un metodo ottimizzato per F1-purificazione dell’atpasi dalla fase del ciclo di vita dell’insetto colta di T. brucei. Il metodo è sviluppato basato su protocolli stabiliti per l’isolamento di bovini e lievito F1– ATPasi21,22. La procedura produce altamente puro e omogeneo enzima adatto in vitro enzimatico e inibitorio saggi, proteomica dettagliata caratterizzazione mediante spettrometria di massa23e struttura determinazione24. Il protocollo di purificazione e la conoscenza del F1-ATPasi struttura a livello atomico si apre la possibilità di progettare le schermate per identificare piccole molecole inibitori e facilitare lo sviluppo di nuovi farmaci contro trypanosomiases africano. Inoltre, il protocollo può essere adattato per purificare F1-atpasi da altri organismi.
Il protocollo per F1-purificazione dell’atpasi da T. brucei è stato sviluppato precedentemente pubblicati basata su metodi per l’isolamento di F1-complessi di atpasi da altre specie13,14. Il metodo non richiede alcuna modificazione genetica (ad es., tagging) e produce un complesso completamente attivo con tutte le subunità presenti. Il punto cruciale è il rilascio di cloroformio-facilitato di F1-ATPasi dalla p…
The authors have nothing to disclose.
Questo lavoro è stato finanziato dal Ministero di educazione ERC CZ concedere LL1205, la concessione di Grant Agency di Repubblica Ceca 18-17529S e dal FESR/FSE progetto centro per la ricerca di patogenicità e virulenza dei parassiti (No. CZ.02.1.01/0.0/0.0/16_019/0000759).
Chemicals | |||
Adenosin Diphosphate Disodium Salt (ADP) | Applichem | A0948 | |
Amastatin Hydrochloride | Glantham Life Sciences | GA1330 | |
Aminocaproic Acid | Applichem | A2266 | |
BCA Protein Assay Kit | ThermoFischer Scientific/Pierce | 23225 | |
Benzamidine Hydrochloride | Calbiochem | 199001 | |
Bestatin Hydrochloride | Sigma Aldrich/Merck | B8385 | |
Chloroform | Any supplier | ||
cOmplete Tablets, Mini EDTA-free | Roche | 4693159001 | Protease inhibitor cocktail tablets |
Ethylenediaminetetraacetic Acid (EDTA) | Any supplier | ||
Hydrochloric Acid | Any supplier | For pH adjustment | |
Ile-Pro-Ile | Sigma Aldrich/Merck | I9759 | Alias Diprotin A |
Leupeptin | Sigma Aldrich/Merck | L2884 | |
Magnesium Sulfate Heptahydrate | Any supplier | ||
Pepstatin A | Sigma Aldrich/Merck | P5318 | |
Protein Electrophoresis System | Any supplier | ||
Sodium Chloride | Any supplier | ||
Sucrose | Any supplier | ||
Tris | Any supplier | ||
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Consumables | |||
Centrifuge Tubes for SW60Ti, Polyallomer | Beckman Coulture | 328874 | |
DounceTissues Homogenizer 2 mL | Any supplier | ||
Glass Vacuum Filtration Device | Sartorius | 516-7017 | Degasing solutions for liquid chromatography |
HiTrap Q HP, 5 mL | GE Healthcare Life Sciences | 17115401 | Anion exchange chromatography column |
Regenaretad Cellulose Membrane Filters, pore size 0.45 μm, diameter 47 mm | Sartorius | 18406–47——N | Degasing solutions for liquid chromatography |
Superdex 200 Increase 10/300 GL | GE Healthcare Life Sciences | 29091596 | Size-exclusion chromatography column |
Vivaspin 6 MWCO 100 kDa PES | Sartorius | VS0641 | |
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Equipment | |||
AKTA Pure 25 | GE Healthcare Life Sciences | 29018224 | Or similar FPLC system |
Spectrophotometer Shimadzu UV-1601 | Shimadzu | Or similar spectrophotometer with kinetic assay mode | |
Ultracentrifuge Beckman Optima with SW60Ti Rotor | Beckman Coulture | Or similar ultracentrifuge and rotor | |
Ultrasonic Homogenizer with Thin Probe, Model 3000 | BioLogics | 0-127-0001 | Or similar ultrasonic homogenizer |