Isolatie van F1-ATPase van de parasitaire Protist Trypanosoma brucei
Summary
Dit protocol beschrijft de zuivering van F1-ATPase van de gekweekte insecten fase van Trypanosoma brucei. De procedure levert een zeer zuivere, homogene en actieve complex geschikt voor structurele en enzymatische studies.
Abstract
F1-ATPase is een membraan-extrinsieke katalytische subcomplex van F-type ATP-synthase, een enzym dat de proton motive force over biologische membranen gebruikt voor de productie van adenosine trifosfaat (ATP). Het isolement van de intact F1-ATPase van de inheemse bron is een essentiële voorwaarde voor het karakteriseren van het enzym eiwit samenstelling, kinetische parameters en gevoeligheid voor inhibitoren. Een zeer zuivere en homogene F1-ATPase kan worden gebruikt voor structurele studies, die inzicht geven in de moleculaire mechanismen van de ATP-synthese en hydrolyse. Dit artikel beschrijft een procedure voor de zuivering van de F-1-ATPase van Trypanosoma brucei, de verwekker van Afrikaanse trypanosomiasen. De F-1-ATPase is geïsoleerd van mitochondriale blaasjes, die zijn verkregen door hypotone lysis van trypanosomen in vitro gekweekt. De blaasjes zijn mechanisch gefragmenteerd door ultrasoonapparaat en de F-1-ATPase vrijkomt uit het binnenste van de mitochondriale membraan door de chloroform extractie. De enzymatische complex wordt verder gezuiverd door opeenvolgende anion uitwisseling en grootte-uitsluiting chromatografie. Gevoelige massaspectrometrie technieken bleek dat het gezuiverde complex verstoken van vrijwel elk eiwit contaminanten is en daarom geschikt materiaal voor structuurbepaling door middel van röntgendiffractie of cryo-elektronenmicroscopie vertegenwoordigt. De geïsoleerde F1-ATPase vertoont ATP Hydrolytische activiteit, die volledig kan worden geremd door natriumazide, een krachtige remmer van F-type ATP synthases. Het gezuiverde complex blijft stabiel en actief gedurende ten minste drie dagen bij kamertemperatuur. Neerslag door ammonium sulfaat wordt gebruikt voor langetermijnopslag. Soortgelijke procedures zijn gebruikt voor de zuivering van F1– ATPasen van zoogdier- en plantaardige weefsels, gisten of bacteriën. Dus, het voorgestelde protocol kan dienen als richtsnoer voor de F-1-ATPase los van andere organismen.
Introduction
De F-type ATP synthases zijn membraan-gebonden roterende multiprotein complexen die paar proton translocatie over energie-transducing membranen van bacteriën, mitochondria en chloroplasten met de vorming van ATP. Moleculaire gegevens van het roterende mechanisme van de ATP-synthese bekend zijn voornamelijk vanwege structurele studies van gezuiverde bacteriële en mitochondriale ATP synthases en hun subcomplexes1. F-type ATP-synthase is onderverdeeld in de membraan-intrinsieke en extrinsieke membraan wordt. Het membraan-extrinsieke deel, bekend als F1-ATPase, bevat drie katalytische sites, waar de fosforylatie van adenosinedifosfaat (ADP) naar ATP of de omgekeerde reactie optreedt. F1-ATPase kan worden vrijgegeven experimenteel van de membraan-intrinsieke groep met behoud van haar vermogen om te hydrolyseren, maar niet synthetiseren, ATP. De sector van de membraan-gebonden, genaamd Fo, bemiddelt eiwit translocatie, die de rotatie van het centrale deel van het enzym drijft. De F-1 en Fo sectoren zijn verbonden door de centrale en perifere stengels.
De eerste pogingen om te zuiveren van de F-1-ATPase van ontluikende gist en boviene hart mitochondriën datum terug naar de jaren 1960. Deze protocollen gebruikt geëxtraheerd mitochondriën, die werden verstoord door ultrasoonapparaat, gespreide door ammonium of tijdje sulfaat neerslag, gevolgd door een optionele chromatografie stappen en warmtebehandeling2,3,4 ,5,6. De zuivering is sterk verbeterd en vereenvoudigd door het gebruik van chloroform, die gemakkelijk de versies van de F-1-ATPase van de mitochondriale membraan fragmenten7. De chloroform winning werd vervolgens gebruikt om te uittreksel van F1– ATPasen van diverse dier, plant en bacteriële bronnen (bijvoorbeeld, rat lever8, maïs9, Gevlekte aronskelk10en Escherichia coli 11). Verdere zuivering van de chloroform-vrijgegeven F1-ATPase door affiniteit of grootte-uitsluiting chromatography (SEC) leverde een zeer zuivere eiwit complex, die geschikt voor hoge resolutie structuurbepaling door middel van röntgendiffractie was, als gedocumenteerd door de structuren van F1-ATPase van boviene hart12,13 en14van de Saccharomyces cerevisiae. F1-ATPase structuren werden ook bepaald op basis van organismen die moeilijk te cultiveren en, dus, het bedrag van het eerste biologisch materiaal was beperkt. In dit geval, de F-1-ATPase subeenheden kunstmatig werden uitgedrukt en samengevoegd tot het complex in E. coli, en het hele heterologe enzym werd gezuiverd door affiniteit chromatografie via een gecodeerde subeenheid. Dergelijke aanpak heeft geleid tot de vaststelling van F1-ATPase structuren uit twee thermofiele bacteriesoorten, Geobacillus stearothermophilus15 en Caldalkalibacillus thermarum16, 17. deze methode is echter nogal ongeschikt voor eukaryotische F1– ATPasen aangezien zij beroept zich op de prokaryote protheosynthetic toestellen, posttranslationele verwerking en complexe assemblage.
De winning van chloroform gebaseerde werd eerder gebruikt om te isoleren F1– ATPasen van digenetic van eencellige parasieten Trypanosoma cruzi18 en T. brucei19, belangrijke zoogdieren ziekteverwekkers, waardoor Amerikaanse en Afrikaanse trypanosomiasen, respectievelijk, en van monogeen insect-parasiet Crithidia fasciculata20. Deze zuivering leidde slechts tot een eenvoudige beschrijving van de F-1– ATPasen, aangezien geen downstream toepassingen werden gebruikt om de samenstelling, structuur en enzymatische eigenschappen van het complex volledig te karakteriseren. Dit artikel beschrijft een geoptimaliseerde methode voor F1-ATPase zuivering van de fase van de levenscyclus van de gekweekte insecten van T. brucei. De methode is ontwikkeld op basis van de vastgestelde protocollen voor isolatie van runderen en gist F1– ATPasen21,22. De procedure levert zeer zuiver en homogene enzym geschikt voor in vitro enzymatische en remmende testen, gedetailleerde proteomic karakterisering door massaspectrometrie23en structuur vastberadenheid24. Het protocol van de reiniging en de kennis van de F-1-ATPase structuur op het atomaire niveau opent een mogelijkheid voor het ontwerpen van de schermen te identificeren kleine-molecuul remmers, steun bij de ontwikkeling van nieuwe medicijnen tegen Afrikaanse trypanosomiasen. Bovendien, het protocol kan worden aangepast aan het zuiveren van F1-ATPase van andere organismen.
Protocol
Representative Results
Discussion
Het protocol voor F1-ATPase zuivering van T. brucei werd ontwikkeld op basis van eerder gepubliceerde maatregelen voor de isolering van F1-ATPase complexen van andere soorten13,14. De methode vereist geen genetische wijzigingen (bijvoorbeeld, tagging) en levert een volledig actieve complex met alle subeenheden aanwezig. De cruciale stap is de chloroform-vergemakkelijkt release van de F-1-ATPase uit het membraan-i…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dit werk werd gefinancierd door het ministerie van onderwijs ERC CZ verlenen van LL1205, de toekenning van de subsidie Agentschap van Tsjechië 18-17529S, en door het EFRO/ESF project centrum voor onderzoek van de pathogeniteit en de virulentie van parasieten (nr. CZ.02.1.01/0.0/0.0/16_019/0000759).
Materials
| Chemicals | |||
| Adenosin Diphosphate Disodium Salt (ADP) | Applichem | A0948 | |
| Amastatin Hydrochloride | Glantham Life Sciences | GA1330 | |
| Aminocaproic Acid | Applichem | A2266 | |
| BCA Protein Assay Kit | ThermoFischer Scientific/Pierce | 23225 | |
| Benzamidine Hydrochloride | Calbiochem | 199001 | |
| Bestatin Hydrochloride | Sigma Aldrich/Merck | B8385 | |
| Chloroform | Any supplier | ||
| cOmplete Tablets, Mini EDTA-free | Roche | 4693159001 | Protease inhibitor cocktail tablets |
| Ethylenediaminetetraacetic Acid (EDTA) | Any supplier | ||
| Hydrochloric Acid | Any supplier | For pH adjustment | |
| Ile-Pro-Ile | Sigma Aldrich/Merck | I9759 | Alias Diprotin A |
| Leupeptin | Sigma Aldrich/Merck | L2884 | |
| Magnesium Sulfate Heptahydrate | Any supplier | ||
| Pepstatin A | Sigma Aldrich/Merck | P5318 | |
| Protein Electrophoresis System | Any supplier | ||
| Sodium Chloride | Any supplier | ||
| Sucrose | Any supplier | ||
| Tris | Any supplier | ||
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Consumables | |||
| Centrifuge Tubes for SW60Ti, Polyallomer | Beckman Coulture | 328874 | |
| DounceTissues Homogenizer 2 mL | Any supplier | ||
| Glass Vacuum Filtration Device | Sartorius | 516-7017 | Degasing solutions for liquid chromatography |
| HiTrap Q HP, 5 mL | GE Healthcare Life Sciences | 17115401 | Anion exchange chromatography column |
| Regenaretad Cellulose Membrane Filters, pore size 0.45 μm, diameter 47 mm | Sartorius | 18406–47——N | Degasing solutions for liquid chromatography |
| Superdex 200 Increase 10/300 GL | GE Healthcare Life Sciences | 29091596 | Size-exclusion chromatography column |
| Vivaspin 6 MWCO 100 kDa PES | Sartorius | VS0641 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Equipment | |||
| AKTA Pure 25 | GE Healthcare Life Sciences | 29018224 | Or similar FPLC system |
| Spectrophotometer Shimadzu UV-1601 | Shimadzu | Or similar spectrophotometer with kinetic assay mode | |
| Ultracentrifuge Beckman Optima with SW60Ti Rotor | Beckman Coulture | Or similar ultracentrifuge and rotor | |
| Ultrasonic Homogenizer with Thin Probe, Model 3000 | BioLogics | 0-127-0001 | Or similar ultrasonic homogenizer |
References
- Walker, J. E., Wikström, M. Structure, mechanism and regulation of ATP synthases. Mechanisms of Primary Energy Transduction in Biology. , 338-373 (2017).
- Pullman, M. E., Penefsky, H. S., Datta, A., Racker, E. Partial resolution of the enzymes catalyzing oxidative phosphorylation. I. Purification and properties of soluble dinitrophenol-stimulated adenosine triphosphatase. The Journal of Biological Chemistry. 235, 3322-3329 (1960).
- Schatz, G., Penefsky, H. S., Racker, E. Partial resolution of the enzymes catalyzing oxidative phosphorylation. XIV. The Journal of Biological Chemistry. 242 (10), 2552-2560 (1967).
- Racker, E., Horstman, L. L. Partial resolution of the enzymes catalyzing oxidative phosphorylation. 13. Structure and function of submitochondrial particles completely resolved with respect to coupling factor. The Journal of Biological Chemistry. 242 (10), 2547-2551 (1967).
- Senior, A. E., Brooks, J. C. Studies on the mitochondrial oligomycin-insensitive ATPase. I. An improved method of purification and the behavior of the enzyme in solutions of various depolymerizing agents. Archives of Biochemistry and Biophysics. 140 (1), 257-266 (1970).
- Tzagoloff, A., Meagher, P. Assembly of the mitochondrial membrane system. V. Properties of a dispersed preparation of the rutamycin-sensitive adenosine triphosphatase of yeast mitochondria. The Journal of Biological Chemistry. 246 (23), 7328-7336 (1971).
- Beechey, R. B., Hubbard, S. A., Linnett, P. E., Mitchell, A. D., Munn, E. A. A simple and rapid method for the preparation of adenosine triphosphatase from submitochondrial particles. Biochemical Journal. 148 (3), 533-537 (1975).
- Tyler, D. D., Webb, P. R. Purification and properties of the adenosine triphosphatase released from the liver mitochondrial membrane by chloroform. Biochemical Journal. 178 (2), 289-297 (1979).
- Hack, E., Leaver, C. J. The alpha-subunit of the maize F1-ATPase is synthesised in the mitochondrion. The EMBO Journal. 2 (10), 1783-1789 (1983).
- Dunn, P. P., Slabas, A. R., Moore, A. L. Purification of F1-ATPase from cuckoo-pint (Arum maculatum) mitochondria. A comparison of subunit composition with that of rat liver F1-ATPase. Biochemical Journal. 225 (3), 821-824 (1985).
- Satre, M., Bof, M., Vignais, P. V. Interaction of Escherichia coli adenosine triphosphatase with aurovertin and citreoviridin: inhibition and fluorescence studies. Journal of Bacteriology. 142 (3), 768-776 (1980).
- Abrahams, J. P., Leslie, A. G., Lutter, R., Walker, J. E. Structure at 2.8 Å resolution of F1ATPase from bovine heart mitochondria. Nature. 370 (6491), 621-628 (1994).
- Lutter, R., et al. Crystallization of F1-ATPase from bovine heart mitochondria. Journal of Molecular Biology. 229 (3), 787-790 (1993).
- Kabaleeswaran, V., Puri, N., Walker, J. E., Leslie, A. G., Mueller, D. M. Novel features of the rotary catalytic mechanism revealed in the structure of yeast F1-ATPase. The EMBO Journal. 25 (22), 5433-5442 (2006).
- Shirakihara, Y., et al. Structure of a thermophilic F1-ATPase inhibited by an epsilon-subunit: deeper insight into the epsilon-inhibition mechanism. The FEBS Journal. 282 (15), 2895-2913 (2015).
- Stocker, A., Keis, S., Cook, G. M., Dimroth, P. Purification, crystallization, and properties of F1-ATPase complexes from the thermoalkaliphilic Bacillus sp. strain TA2.A1. Journal of Structural Biology. 152 (2), 140-145 (2005).
- Ferguson, S. A., Cook, G. M., Montgomery, M. G., Leslie, A. G., Walker, J. E. Regulation of the thermoalkaliphilic F1-ATPase from Caldalkalibacillus thermarum. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (39), 10860-10865 (2016).
- Cataldi de Flombaum, M. A., Frasch, A. C. C., Stoppani, A. O. M. Adenosine triphosphatase from Trypanosoma cruzi: purification and properties. Comparative Biochemistry and Physiology Part B: Comparative Biochemistry. 65 (1), 103-109 (1980).
- Williams, N., Frank, P. H. The mitochondrial ATP synthase of Trypanosoma brucei: isolation and characterization of the intact F1 moiety. Molecular and Biochemical Parasitology. 43 (1), 125-132 (1990).
- Higa, A. I., Cazzulo, J. J. Mg2+-activated adenosine triphosphatase from Crithidia fasciculata: purification and inhibition by suramin and efrapeptin. Molecular and Biochemical Parasitology. 3 (6), 357-367 (1981).
- Walker, J. E., et al. Primary structure and subunit stoichiometry of F1-ATPase from bovine mitochondria. Journal of Molecular Biology. 184 (4), 677-701 (1985).
- Mueller, D. M., et al. Ni-chelate-affinity purification and crystallization of the yeast mitochondrial F1-ATPase. Protein Expression and Purification. 37 (2), 479-485 (2004).
- Gahura, O., et al. The F1-ATPase from Trypanosoma brucei is elaborated by three copies of an additional p18-subunit. The FEBS Journal. 285 (3), 614-628 (2018).
- Montgomery, M. G., Gahura, O., Leslie, A. G. W., Zikova, A., Walker, J. E. ATP synthase from Trypanosoma brucei has an elaborated canonical F1-domain and conventional catalytic sites. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 115 (9), 2102-2107 (2018).
- Schneider, A., Charriere, F., Pusnik, M., Horn, E. K. Isolation of mitochondria from procyclic Trypanosoma brucei. Methods in Molecular Biology. 372, 67-80 (2007).
- Smith, P. K., et al. Measurement of protein using bicinchoninic acid. Analytical Biochemistry. 150 (1), 76-85 (1985).
- Wirtz, E., Leal, S., Ochatt, C., Cross, G. A. A tightly regulated inducible expression system for conditional gene knock-outs and dominant-negative genetics in Trypanosoma brucei. Molecular and Biochemical Parasitology. 99 (1), 89-101 (1999).
- Speijer, D., et al. Characterization of the respiratory chain from cultured Crithidia fasciculata. Molecular and Biochemical Parasitology. 85 (2), 171-186 (1997).
- Nelson, R. E., Aphasizheva, I., Falick, A. M., Nebohacova, M., Simpson, L. The I-complex in Leishmania tarentolae is an uniquely-structured F1-ATPase. Molecular and Biochemical Parasitology. 135 (2), 221-224 (2004).
- Carbajo, R. J., et al. How the N-terminal domain of the OSCP subunit of bovine F1Fo-ATP synthase interacts with the N-terminal region of an alpha subunit. Journal of Molecular Biology. 368 (2), 310-318 (2007).
- Bowler, M. W., Montgomery, M. G., Leslie, A. G., Walker, J. E. Ground state structure of F1-ATPase from bovine heart mitochondria at 1.9 Å resolution. The Journal of Biological Chemistry. 282 (19), 14238-14242 (2007).
