Este protocolo describe la purificación de F1-ATPasa de la etapa de insectos cultivada de Trypanosoma brucei. El procedimiento produce un complejo altamente puro, homogéneo y activo adecuado para estudios estructurales y enzimáticos.
F1-ATPasa es un subcomplex catalítico membranas extrínsecas de tipo F ATP sintasa, una enzima que utiliza la fuerza motriz de protones a través de membranas biológicas para producir trifosfato de adenosina (ATP). El aislamiento de la intacta F1-ATPasa de la fuente nativa es un requisito previo esencial para caracterizar la composición proteica, parámetros cinéticos y sensibilidad a los inhibidores de la enzima. Un altamente pura y homogénea F1-ATPasa puede ser utilizada para estudios estructurales, que proporcionan la penetración en mecanismos moleculares de la síntesis de ATP y a la hidrólisis. Este artículo describe un procedimiento para la purificación de la F1-ATPasa de Trypanosoma brucei, el agente causal de la tripanosomiasis africanas. F1-ATPasa está aislada de las vesículas mitocondriales, que son obtenidas por lisis hipotónica de tripanosomas en vitro cultivados. Las vesículas son fragmentadas mecánicamente por sonicación y F1-ATPasa se libera de la membrana interna mitocondrial por la extracción de cloroformo. El complejo enzimático es más purificado por intercambio del anión consecutivos y cromatografía por exclusión de tamaño. Técnicas de espectrometría de masas sensibles demostraron que el complejo purificado está desprovisto de cualquier contaminantes de la proteína y, por lo tanto, representa el material adecuado para la determinación de la estructura por cristalografía de rayos x o microscopia del cryo-electrón. Los aislados de F1-ATPasa exhibe actividad hidrolítica de la ATP, que puede ser inhibida totalmente por la azida sódica, un inhibidor potente del tipo F ATP sintasas. El complejo purificado permanece estable y activo por lo menos tres días a temperatura ambiente. Precipitación por sulfato de amonio se utiliza para almacenamiento a largo plazo. Procedimientos similares se han utilizado para la purificación de F1– ATPasas de los tejidos de mamíferos y plantas, levaduras y bacterias. Así, el protocolo presentado puede servir como una guía para la F1-aislamiento de ATPasa de otros organismos.
El tipo F ATP sintasas son membrana-limite rotación complejos de multiproteínas translocación de protón de pareja a través de membranas transductoras de energía de las bacterias, mitocondrias y cloroplastos con la formación de ATP. Detalles moleculares del mecanismo rotacional de la síntesis de ATP son conocidos principalmente por los estudios estructurales de purificada bacterianas y mitocondriales ATP sintasas y sus Subcomplejos de mando1. Tipo F ATP sintasa se organiza en moléculas de membrana-intrínsecas y extrínsecas de la membrana. La parte extrínseca de la membrana, conocida como F1-ATPasa, contiene tres sitios catalíticos, donde se produce la fosforilación del Adenosín difosfato (ADP) a ATP o la reacción reversa. F1-ATPasa puede liberarse experimentalmente la parte intrínseca de la membrana mientras que conserva su capacidad de hidrolizar pero no sintetizar, ATP. El sector unida a la membrana, llamado Fo, media la translocación de la proteína, que impulsa la rotación de la parte central de la enzima. La F1 y Fo sectores están conectados por los tallos centrales y periféricos.
Los primeros intentos purificar la F1-ATPasa de la levadura de florecimiento y la fecha de las mitocondrias de corazón bovino hacia la década de 1960. Estos protocolos utilizados extraen las mitocondrias, que fueron interrumpidas por sonicación, fraccionado por la precipitación de sulfato amónico o protamina, seguido de cromatografía opcional pasos y tratamiento térmico2,3,4 ,5,6. La purificación fue grandemente mejorada y simplificada por el uso de cloroformo, que libera fácilmente la F1-ATPasa de la membrana mitocondrial fragmentos7. La extracción de cloroformo entonces fue utilizada para extraer F1– ATPasas de varios animales, plantas y fuentes bacterianas (p. ej., hígado de rata8, maíz9, Arum maculatum10y de Escherichia coli 11). Más purificación de liberado cloroformo F1-ATPasa por cromatografía de afinidad o de exclusión de tamaño (SEC) produjo una proteína altamente pura compleja, que era conveniente para la determinación de la estructura de alta resolución por cristalografía de rayos x, como documentado por las estructuras de F1-ATPasa de corazón bovino12,13 y14de la Saccharomyces cerevisiae. F1-estructuras de ATPasa también se determinaron de organismos que son difíciles de cultivar y, por lo tanto, la cantidad de la materia biológica inicial fue limitada. En este caso, F1-ATPase subunidades fueron artificialmente expresados y montados en el complejo de e. coli, y la enzima entera heteróloga se purificó por cromatografía de afinidad a través de una subunidad etiquetada. Tal planteamiento condujo a la determinación de F1-estructuras de la ATPasa de dos especies bacterianas termófilas, Geobacillus stearothermophilus15 y thermarum Caldalkalibacillus16, 17. sin embargo, esta metodología es algo inadecuada para eucariotas F1– ATPasas puesto que se basa en el aparato protheosynthetic procariotas procesamiento postraduccional y montaje complejo.
La extracción de cloroformo-basado fue utilizada previamente para aislar F1– ATPasas de trematodos unicelulares parásitos Trypanosoma cruzi18 y T. brucei19importantes patógenos mamíferos causando americano y Tripanosomiasis africanas, respectivamente y de parásito de insectos monogénica Crithidia fasciculata20. Estas purificaciones condujeron sólo a una simple Descripción de la F1– ATPasas, puesto que no hay aplicaciones posteriores fueron utilizadas para caracterizar completamente la composición, estructura y características enzimáticas del complejo. Este artículo describe un método optimizado para la F1-purificación de la ATPasa de la etapa del ciclo de vida de insectos cultivados de T. brucei. El método se desarrolla en base a los protocolos establecidos para el aislamiento de bovinos y levadura F1– ATPasas21,22. El procedimiento produce enzima altamente pura y homogénea adecuada para en vitro enzimática inhibitoria ensayos y, proteómicos detallada caracterización por espectrometría de masas23y estructura determinación24. El protocolo de purificación y el conocimiento de la F1-estructura de la ATPasa a nivel atómico abre una posibilidad para el diseño de pantallas para identificar inhibidores de molécula pequeña y ayudar en el desarrollo de nuevos fármacos contra la tripanosomiasis africanas. Por otra parte, el protocolo puede ser adaptado para purificar F1-ATPasa de otros organismos.
El protocolo para F1-purificación de ATPasa de T. brucei se desarrolló en base a métodos previamente publicados para el aislamiento de F1-complejos de ATPasa de otras especies13,14. El método no requiere ninguna modificación genética (p. ej., etiquetado) y produce un complejo activo con todas las subunidades presentes. El paso crucial es la liberación facilitada de cloroformo de la F1-ATPasa de la membrana…
The authors have nothing to disclose.
Este trabajo fue financiado por el Ministerio de educación ERC CZ conceder LL1205, la concesión de la beca Agencia de República Checa 18-17529S y por FEDER/FSE del proyecto centro de investigación de patogenicidad y virulencia de los parásitos (no. CZ.02.1.01/0.0/0.0/16_019/0000759).
Chemicals | |||
Adenosin Diphosphate Disodium Salt (ADP) | Applichem | A0948 | |
Amastatin Hydrochloride | Glantham Life Sciences | GA1330 | |
Aminocaproic Acid | Applichem | A2266 | |
BCA Protein Assay Kit | ThermoFischer Scientific/Pierce | 23225 | |
Benzamidine Hydrochloride | Calbiochem | 199001 | |
Bestatin Hydrochloride | Sigma Aldrich/Merck | B8385 | |
Chloroform | Any supplier | ||
cOmplete Tablets, Mini EDTA-free | Roche | 4693159001 | Protease inhibitor cocktail tablets |
Ethylenediaminetetraacetic Acid (EDTA) | Any supplier | ||
Hydrochloric Acid | Any supplier | For pH adjustment | |
Ile-Pro-Ile | Sigma Aldrich/Merck | I9759 | Alias Diprotin A |
Leupeptin | Sigma Aldrich/Merck | L2884 | |
Magnesium Sulfate Heptahydrate | Any supplier | ||
Pepstatin A | Sigma Aldrich/Merck | P5318 | |
Protein Electrophoresis System | Any supplier | ||
Sodium Chloride | Any supplier | ||
Sucrose | Any supplier | ||
Tris | Any supplier | ||
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Consumables | |||
Centrifuge Tubes for SW60Ti, Polyallomer | Beckman Coulture | 328874 | |
DounceTissues Homogenizer 2 mL | Any supplier | ||
Glass Vacuum Filtration Device | Sartorius | 516-7017 | Degasing solutions for liquid chromatography |
HiTrap Q HP, 5 mL | GE Healthcare Life Sciences | 17115401 | Anion exchange chromatography column |
Regenaretad Cellulose Membrane Filters, pore size 0.45 μm, diameter 47 mm | Sartorius | 18406–47——N | Degasing solutions for liquid chromatography |
Superdex 200 Increase 10/300 GL | GE Healthcare Life Sciences | 29091596 | Size-exclusion chromatography column |
Vivaspin 6 MWCO 100 kDa PES | Sartorius | VS0641 | |
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Equipment | |||
AKTA Pure 25 | GE Healthcare Life Sciences | 29018224 | Or similar FPLC system |
Spectrophotometer Shimadzu UV-1601 | Shimadzu | Or similar spectrophotometer with kinetic assay mode | |
Ultracentrifuge Beckman Optima with SW60Ti Rotor | Beckman Coulture | Or similar ultracentrifuge and rotor | |
Ultrasonic Homogenizer with Thin Probe, Model 3000 | BioLogics | 0-127-0001 | Or similar ultrasonic homogenizer |