Isolamento de F1-ATPase do Protista parasita Trypanosoma brucei
Summary
Este protocolo descreve a purificação de F1-ATPase do palco inseto cultivado de Trypanosoma brucei. O procedimento produz um complexo altamente puro, homogêneo e ativo adequado para estudos estruturais e enzimáticos.
Abstract
F1-ATPase é uma membrana-extrínseco subcomplex catalítico de F-tipo ATP sintase, uma enzima que utiliza a força motriz protónica através das membranas biológicas para produzir adenosina trifosfato (ATP). O isolamento do intacta F1-ATPase da sua nascente nativo é um pré-requisito essencial para caracterizar a enzima composição de proteína, parâmetros cinéticos e sensibilidade aos inibidores. Um altamente pura e homogênea F1-ATPase pode ser usada para estudos estruturais, que fornecem a introspecção do mecanismo molecular da síntese de ATP e hidrólise. Este artigo descreve um procedimento para a purificação do F1-ATPase de Trypanosoma brucei, o agente causador da trypanosomiases africanos. A F-1-ATPase é isolada de vesículas mitocondriais, que são obtidas por lise hipotónica de tripanosomas em vitro cultivadas. As vesículas são mecanicamente fragmentadas por sonication e o F1-ATPase é liberada a partir da membrana mitocondrial interna pela extração de clorofórmio. O complexo enzimático é mais purificado por aniões consecutivos e cromatografia de exclusão de tamanho. Técnicas de espectrometria de massa sensível mostraram que o complexo purificado é desprovido de praticamente qualquer contaminantes de proteína e, portanto, representa o material adequado para a determinação de estrutura por cristalografia de raios x ou microscopia cryo-elétron. O isolado F1-ATPase apresenta atividade hidrolítica de ATP, que pode ser totalmente inibida por azida sódica, um inibidor potente do F-tipo ATP sintases. O complexo purificado permanece estável e ativo pelo menos três dias à temperatura ambiente. Precipitação de sulfato de amônio é usada para o armazenamento a longo prazo. Procedimentos semelhantes têm sido utilizados para a purificação de F1– ATPase de tecidos de mamíferos e vegetais, leveduras ou bactérias. Assim, o protocolo apresentado pode servir como uma diretriz para a F-1-isolamento de ATPase de outros organismos.
Introduction
Os F-tipo ATP sintases estão ligados a membrana rotativa complexos Multiproteicos translocação de prótons que casal entre energia-transducing membranas de cloroplastos, mitocôndrias e bactérias com a formação de ATP. Detalhes moleculares do mecanismo rotacional da síntese de ATP são conhecidos principalmente por causa de estudos estruturais de purificado bacteriana e mitochondrial ATP sintases e seus subcomplexes1. F-tipo ATP sintase está organizado em partes da membrana-intrínsecos e extrínsecos-membrana. A parte da membrana-extrínseco, conhecida como F1-ATPase, contém três sites catalíticos, onde ocorre a fosforilação de difosfato de adenosina (ADP) para ATP ou a reação inversa. F1-ATPase pode ser libertada experimentalmente o moiety intrínsecas da membrana mantendo sua capacidade de hidrolisar, mas não sintetizar, ATP. O setor de membrana-limite, chamado Fó, Medeia a translocação da proteína, que leva a rotação da parte central da enzima. Os setores deó de F e F1 são conectados pelos talos centrais e periféricos.
O primeiro tenta purificar o F1-ATPase do fermento de brotamento e coração bovinos mitocôndrias data voltar à década de 1960. Estes protocolos usados extraído de mitocôndrias, que foram interrompidas pelo sonication, fracionado por precipitação de sulfato de amônio ou protamina, seguida da execução opcional cromatografia e tratamento térmico2,3,4 ,5,6. A purificação foi grandemente melhorada e simplificada pelo uso de clorofórmio, que prontamente libera o F1-ATPase da membrana mitocondrial fragmentos7. A extração de clorofórmio foi então usada para extrair F1– ATPase de vários animal, vegetal e bacterianas fontes (por exemplo, fígado de ratos8, milho9, Arum maculatum10e Escherichia coli 11). Mais purificação do clorofórmio-lançado F1-ATPase por cromatografia de afinidade ou tamanho-exclusão (SEC) rendeu uma proteína altamente pura complexa, que era adequada para a determinação da estrutura de alta resolução por cristalografia de raios x, como documentado pelas estruturas de F1-ATPase de coração bovino12,13 e Saccharomyces cerevisiae14. F1-estruturas de ATPase determinaram-se também de organismos que são difíceis de cultivar e, assim, a quantidade de matéria biológica inicial foi limitada. Neste caso, a F-1-subunidades ATPase foram artificialmente expressa e montados para o complexo em e. coli, e a enzima heteróloga toda foi purificada por afinidade cromatografia através de uma subunidade marcada. Tal abordagem levou à determinação de F1-estruturas de ATPase de duas espécies de bactérias termofílicas, Geobacillus stearothermophilus15 e Caldalkalibacillus thermarum16, 17. no entanto, esta metodologia é bastante inadequada para eucariontes F1– ATPase desde que baseia-se no aparelho protheosynthetic procarióticas, processamento pós-traducional e montagem complexa.
A extração baseado em clorofórmio foi usada anteriormente para isolar F1– ATPase de digenetic unicelulares parasitas Trypanosoma cruzi18 e T. brucei19, importantes patógenos mamíferos causando americano e Trypanosomiases africanos, respectivamente e de monogénicas inseto parasita Crithidia fasciculata20. Estas purificações levaram apenas para uma simples descrição do F1– ATPase, desde que não há aplicações a jusante foram usadas para caracterizar plenamente a composição, estrutura e propriedades enzimáticas do complexo. Este artigo descreve um método otimizado para F1-purificação ATPase desde a fase do ciclo de vida de inseto culta de T. brucei. O método é desenvolvido com base em protocolos estabelecidos para isolamento de bovinos e levedura F1– ATPase21,22. O procedimento produz altamente pura e homogênea enzima apropriada para em vitro enzimática e inibitórios ensaios, caracterização detalhada proteomic por espectrometria de massa23e de determinação de estrutura24. O protocolo de purificação e o conhecimento da F1-estrutura ATPase do nível atômico abre uma possibilidade para a concepção de telas para identificar inibidores da pequeno-molécula e ajuda no desenvolvimento de novas drogas contra trypanosomiases africanos. Além disso, o protocolo pode ser adaptado para purificar F1-ATPase de outros organismos.
Protocol
Representative Results
Discussion
O protocolo para F1-purificação da ATPase de T. brucei foi desenvolvido com base em métodos publicados anteriormente para o isolamento de F1-complexos de ATPase de outras espécies de13,14. O método não requer qualquer modificação genética (por exemplo, marcação) e produz um complexo totalmente ativo com subunidades de todos os presentes. A etapa crucial é o lançamento de clorofórmio-facilitada do F1…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabalho foi financiado pelo Ministério da educação ERC CZ conceder LL1205, o grant Grant agência de República Checa 18-17529S e pelo FEDER/FSE projeto centro de investigação de patogenicidade e virulência de parasitas (n. º CZ.02.1.01/0.0/0.0/16_019/0000759).
Materials
| Chemicals | |||
| Adenosin Diphosphate Disodium Salt (ADP) | Applichem | A0948 | |
| Amastatin Hydrochloride | Glantham Life Sciences | GA1330 | |
| Aminocaproic Acid | Applichem | A2266 | |
| BCA Protein Assay Kit | ThermoFischer Scientific/Pierce | 23225 | |
| Benzamidine Hydrochloride | Calbiochem | 199001 | |
| Bestatin Hydrochloride | Sigma Aldrich/Merck | B8385 | |
| Chloroform | Any supplier | ||
| cOmplete Tablets, Mini EDTA-free | Roche | 4693159001 | Protease inhibitor cocktail tablets |
| Ethylenediaminetetraacetic Acid (EDTA) | Any supplier | ||
| Hydrochloric Acid | Any supplier | For pH adjustment | |
| Ile-Pro-Ile | Sigma Aldrich/Merck | I9759 | Alias Diprotin A |
| Leupeptin | Sigma Aldrich/Merck | L2884 | |
| Magnesium Sulfate Heptahydrate | Any supplier | ||
| Pepstatin A | Sigma Aldrich/Merck | P5318 | |
| Protein Electrophoresis System | Any supplier | ||
| Sodium Chloride | Any supplier | ||
| Sucrose | Any supplier | ||
| Tris | Any supplier | ||
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Consumables | |||
| Centrifuge Tubes for SW60Ti, Polyallomer | Beckman Coulture | 328874 | |
| DounceTissues Homogenizer 2 mL | Any supplier | ||
| Glass Vacuum Filtration Device | Sartorius | 516-7017 | Degasing solutions for liquid chromatography |
| HiTrap Q HP, 5 mL | GE Healthcare Life Sciences | 17115401 | Anion exchange chromatography column |
| Regenaretad Cellulose Membrane Filters, pore size 0.45 μm, diameter 47 mm | Sartorius | 18406–47——N | Degasing solutions for liquid chromatography |
| Superdex 200 Increase 10/300 GL | GE Healthcare Life Sciences | 29091596 | Size-exclusion chromatography column |
| Vivaspin 6 MWCO 100 kDa PES | Sartorius | VS0641 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Equipment | |||
| AKTA Pure 25 | GE Healthcare Life Sciences | 29018224 | Or similar FPLC system |
| Spectrophotometer Shimadzu UV-1601 | Shimadzu | Or similar spectrophotometer with kinetic assay mode | |
| Ultracentrifuge Beckman Optima with SW60Ti Rotor | Beckman Coulture | Or similar ultracentrifuge and rotor | |
| Ultrasonic Homogenizer with Thin Probe, Model 3000 | BioLogics | 0-127-0001 | Or similar ultrasonic homogenizer |
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