Bu iletişim kuralı F1arıtma açıklar-ATPaz Trypanosoma bruceikültürlü böcek sahneden. Yordamı son derece saf, homojen ve aktif karmaşık yapısal ve enzimatik araştırmaları için uygun verir.
F1-ATPaz F-tipi ATP sentaz, proton sebep kuvvet biyolojik membranlar arasında adenozin trifosfat (ATP) üretmek için kullanır bir enzim bir membran dışsal katalitik subcomplex olduğunu. Yalıtım bozulmadan F1-yerli kaynağından ATPaz enzim protein kompozisyon, kinetik parametrelerin ve inhibitörleri duyarlılık karakterize etmek için önemli bir önkoşul olduğunu. Son derece saf ve homojen F1-ATPaz ATP sentezi ve hidroliz moleküler mekanizmaları içgörü sağlamak yapısal çalışmalar için kullanılır. Bu makalede, F1arıtma için bir yordam açıklanır-ATPaz Trypanosoma brucei, Afrika trypanosomiases hastalığının üzerinden. F1-ATPaz kültürlü vitro Tripanozomlar üzerinden hipotonik lizis tarafından elde edilen mitokondrial veziküller yalıtılmış. Veziküller mekanik sonication ve F1tarafından parçalanmış-ATPaz kloroform çıkarma tarafından iç mitokondri zar–dan serbest bırakmak. Enzimatik karmaşık daha fazla ardışık anyon exchange ve boyutu-dışlama Kromatografi tarafından saf. Hassas kütle spektrometresi teknikleri arıtılmış karmaşık hemen hemen herhangi bir protein kirletici yoksun olduğunu ve bu nedenle, uygun malzeme yapı tayini için x-ışını kristalografisi veya cryo-elektron mikroskobu tarafından temsil eder, gösterdi. İzole F1-ATPaz sergileyen tamamen sodyum azid, güçlü inhibitörü olan F-tipi ATP synthases tarafından inhibe olabilir ATP hydrolytic etkinlik. Arıtılmış karmaşık oda sıcaklığında en az üç gün istikrarlı ve etkin kalır. Yağış amonyum sülfat tarafından uzun süreli depolama için kullanılır. Benzer yordamlar F1arıtma için kullanılan memeli ve bitki dokularında, Maya veya bakteri – ATPases. Böylece, sunulan Protokolü F1için bir kılavuz olarak hizmet verebilir-ATPaz izolasyon diğer organizmalar.
F-tipi ATP synthases membran bağlı multiprotein kompleksleri arasında enerji transducing membranlar bakteri, mitokondri ve kloroplast ATP oluşumu ile bu iki proton translocation döner. Moleküler detaylarını ATP sentezi dönme mekanizması esas olarak saflaştırılmış bakteriyel ve mitokondriyal ATP synthases ve onların subcomplexes1yapısal çalışmalar nedeniyle bilinmektedir. F-tipi ATP sentaz membran içsel ve dışsal membran moieties düzenlenmiştir. F1olarak bilinen membran dışsal bölümü-ATPaz, adenozin nükleotittir (ADP) ATP veya ters tepki fosforilasyon oluştuğu üç katalitik siteleri içerir. F1-ATPaz serbest deneysel olarak membran-iç yan hidrolize ama değil sentez, ATP yeteneğini koruyarak. Fo, denilen membran bağlı sektör enzim’ın dönüşü sürücüler protein translocation aracılık eder. F1 ve Fo sektörlerde merkezi ve periferik SAP tarafından bağlanır.
İlk girişimleri F1arındırmak için-1960’larda başa mayası ve sığır kalp mitokondri tarihi ATPaz. Kullanılan bu protokollerin sonication, amonyum veya protamine sülfat yağış, ardından isteğe bağlı Kromatografi adım (lar) ve ısıl işlem2,3,4 tarafından şeker tarafından kesintiye mitokondri çıkarılan ,5,6. Arıtma büyük ölçüde geliştirilmiş ve kolayca F1bültenleri kloroform kullanılarak Basitleştirilmiş-ATPaz mitokondri zar parçaları7. Kloroform çıkarma sonra F1ayıklamak için kullanılan çeşitli hayvan, bitki ve bakteriyel kaynakları (Örneğin, fare karaciğer8, Mısır9, Arum maculatum10ve Escherichia coli – ATPases 11). Daha fazla arıtma kloroform serbest F1-ATPaz benzeşme veya boyut-dışlama Kromatografi (sn) tarafından x-ışını kristalografisi tarafından yüksek çözünürlüklü yapı belirlenmesi için uygun, bir son derece saf protein kompleksi, vermiştir olarak F1yapılar tarafından belgelenen-ATPaz sığır kalp12,13 ve Saccharomyces cerevisiae14. F1-ATPaz yapıları da yetiştirmek zor olan organizmalar tespit ve böylece, ilk biyolojik malzeme miktarını sınırlı. Bu durumda, F1-ATPaz alt birimleri yapay olarak ifade edilen ve E. colikompleksi içine monte ve bütün Contegra enzim etiketli bir alt birim benzeşme Kromatografi ile tarafından saflaştırıldı. Böyle bir yaklaşım F1belirlenmesine yol açtı-ATPaz yapıları iki termofilik bakteriyel türler, Geobacillus stearothermophilus15 ve Caldalkalibacillus thermarum16, 17. ancak, bu yöntem oldukça ökaryotik F1için uygun değildir – prokaryotik protheosynthetic aparatı, ardından işleme ve karmaşık derleme dayanan bu yana ATPases.
Kloroform tabanlı ayıklama daha önce F1ayırmak için kullanılan – ATPases tek hücreli digenetic parazitler Trypanosoma cruzi18 ve T. brucei19, Amerikan neden önemli memeli patojenlerin ve Afrika trypanosomiases, sırasıyla ve monogenic böcek parazit Crithidia fasciculata20. Bu purifications liderliğindeki F1‘ in sadece basit bir açıklaması için – herhangi bir aşağı akım uygulama tam bileşimi, yapısı ve karmaşık enzimatik özelliklerini tanımlamak için kullanılan bu yana ATPases,. Bu makalede, F1için en iyi duruma getirilmiş bir yöntemi-kültürlü böcek yaşam döngüsü sahne alanı’ndan ATPaz arınma T. brucei. Yöntem dayalı olarak kurulan iletişim kuralları yalıtım sığır ve Maya F1– ATPases21,22için geliştirilmiştir. Yordamı son derece saf ve homojen enzim vitro enzimatik ve inhibitör deneyleri için uygun detaylı proteomik karakterizasyonu kütle spektrometresi23ve yapı belirlenmesi24tarafından verir. Arıtma Protokolü ve bilgi F1-ATPaz yapısı atomik düzeyde küçük molekül inhibitörleri tanımlamak ve Afrika trypanosomiases karşı yeni ilaçların geliştirilmesi yardım ekranları tasarlamak için bir olasılık açar. Ayrıca, protokol F1arındırmak için adapte edilebilir-ATPaz üzerinden diğer organizmalar.
İletişim kuralı için F1-ATPaz arıtma T. brucei üzerinden F1yalıtım için temel alınarak daha önce yayımlanmış yöntemleri geliştirilmiştir-ATPaz kompleksleri diğer türler13,14. Yöntem herhangi bir genetik değişiklik gerektirmez (Örneğin, etiketleme) ve tüm alt mevcut ile tam etkin bir kompleks verimleri. Önemli bir adım kloroform kolaylaştırdı F1sürümüdür-ATPaz enzim membran bağl?…
The authors have nothing to disclose.
Bu eser Eğitim Bakanlığı ERC CZ tarafından finanse edildi LL1205, 18-17529S, Çek Cumhuriyeti Grant ajansı hibe vermek ve Merkezi araştırma patojenitesi ve parazit (No virülans ERDF/ESF tarafından proje CZ.02.1.01/0.0/0.0/16_019/0000759).
Chemicals | |||
Adenosin Diphosphate Disodium Salt (ADP) | Applichem | A0948 | |
Amastatin Hydrochloride | Glantham Life Sciences | GA1330 | |
Aminocaproic Acid | Applichem | A2266 | |
BCA Protein Assay Kit | ThermoFischer Scientific/Pierce | 23225 | |
Benzamidine Hydrochloride | Calbiochem | 199001 | |
Bestatin Hydrochloride | Sigma Aldrich/Merck | B8385 | |
Chloroform | Any supplier | ||
cOmplete Tablets, Mini EDTA-free | Roche | 4693159001 | Protease inhibitor cocktail tablets |
Ethylenediaminetetraacetic Acid (EDTA) | Any supplier | ||
Hydrochloric Acid | Any supplier | For pH adjustment | |
Ile-Pro-Ile | Sigma Aldrich/Merck | I9759 | Alias Diprotin A |
Leupeptin | Sigma Aldrich/Merck | L2884 | |
Magnesium Sulfate Heptahydrate | Any supplier | ||
Pepstatin A | Sigma Aldrich/Merck | P5318 | |
Protein Electrophoresis System | Any supplier | ||
Sodium Chloride | Any supplier | ||
Sucrose | Any supplier | ||
Tris | Any supplier | ||
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Consumables | |||
Centrifuge Tubes for SW60Ti, Polyallomer | Beckman Coulture | 328874 | |
DounceTissues Homogenizer 2 mL | Any supplier | ||
Glass Vacuum Filtration Device | Sartorius | 516-7017 | Degasing solutions for liquid chromatography |
HiTrap Q HP, 5 mL | GE Healthcare Life Sciences | 17115401 | Anion exchange chromatography column |
Regenaretad Cellulose Membrane Filters, pore size 0.45 μm, diameter 47 mm | Sartorius | 18406–47——N | Degasing solutions for liquid chromatography |
Superdex 200 Increase 10/300 GL | GE Healthcare Life Sciences | 29091596 | Size-exclusion chromatography column |
Vivaspin 6 MWCO 100 kDa PES | Sartorius | VS0641 | |
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Equipment | |||
AKTA Pure 25 | GE Healthcare Life Sciences | 29018224 | Or similar FPLC system |
Spectrophotometer Shimadzu UV-1601 | Shimadzu | Or similar spectrophotometer with kinetic assay mode | |
Ultracentrifuge Beckman Optima with SW60Ti Rotor | Beckman Coulture | Or similar ultracentrifuge and rotor | |
Ultrasonic Homogenizer with Thin Probe, Model 3000 | BioLogics | 0-127-0001 | Or similar ultrasonic homogenizer |