F₁の分離-寄生原生トリパノソーマから atp アーゼ

F 型 ATP 合成酵素は膜結合型細菌、ミトコンドリア、葉緑体の ATP の形成と膜をエネルギー伝達を渡るカップル プロトン透過経路が多蛋白質複合体を回転させます。ATP 合成の回転機構の分子の詳細は、精製された細菌やミトコンドリア ATP 合成酵素とその subcomplexes¹の構造の研究のために主に知られています。F 型 ATP 合成酵素は膜組み込みと膜外因性基に編成されます。F₁として知られている膜外因性部-atp アーゼ、ATP または逆の反応にアデノシン二リン酸 (ADP) のリン酸化が発生する 3 つの触媒部位が含まれています。F₁-膜固有の部位から実験的 atp アーゼがリリースされる加水分解、しかしない、ATP を合成する能力を維持しながらことができます。F_oと呼ばれる膜結合型部門は、酵素の中央部分の回転を駆動するタンパク質輸送を仲介します。F₁と F_oセクターは、中枢および末梢の茎によって接続されます。

₁F を浄化するために、最初の試み-ATPase 出芽酵母とウシ心筋ミトコンドリア日付 1960 年代に戻る。これらのプロトコルが使用される抽出アンモニウムまたはプロタミン硫酸塩沈殿物、続いてオプション クロマトグラフィー ステップと熱処理^{2,3,4 分画の超音波によって中断されたミトコンドリア ,5,6}。浄化は大幅改善、F₁を容易に解放するクロロホルムの使用で簡素化-ミトコンドリア膜 ATPase の断片⁷。クロロホルム抽出、F₁の抽出に使用された様々 な動物、植物、細菌の源 (例えばラット肝⁸トウモロコシ⁹アルムのニンジン¹⁰、および大腸菌大腸菌型 Atpase ¹¹)。さらにクロロホルム リリース F₁の精製-atp アーゼ アフィニティまたはサイズ排除クロマトグラフィー (SEC) で得られた x 線結晶構造解析による高分解能構造解析に適していた、非常に純粋なタンパク質複合体、として₁F の構造によって文書化-ウシ心筋^12,13と酵母¹⁴ATPase。F₁-atp アーゼ構造も耕しにくい生物から決定した、したがって、最初の生物学的材料の量は限られていた。この場合は、F₁-atp アーゼのサブユニットが人工的に表現し、エシェリヒア属大腸菌、複雑に組み立てし、全く異種酵素の親和性クロマトグラフィー経由でタグ サブユニットを精製しました。このようなアプローチは、F₁の決定につながった-2 好熱性細菌種や株中等度好熱¹⁵ Caldalkalibacillus thermarum^16,からの atp アーゼの構造¹⁷です。 ただし、この方法は適していませんむしろ真核生物の F₁型 Atpase それは原核生物 protheosynthetic 装置、翻訳処理、および複雑なアセンブリに依存しているので。

クロロホルムを用いた抽出 F₁を分離に使用していた型 Atpase 単細胞ミナミハタンポ寄生虫cruzi¹⁸とt. グリコシルホスファチジルイノシトール¹⁹アメリカを引き起こす重要な哺乳類の病原体から、アフリカの trypanosomiases、それぞれ、およびイネ昆虫寄生虫クリシジアファシクラータ²⁰から。これらの浄化は、F₁の簡単な説明だけに主導型 Atpase、組成、構造、および複合体の酵素学的性質を完全に特徴づける下流のアプリケーションが使われていませんので。F₁の最適化方法について説明します- t. 血の培養昆虫のライフ サイクル段階から atp アーゼ浄化。メソッドは、ウシおよび酵母 F₁型 Atpase^21,22の隔離のための確立したプロトコルに基づいて開発です。プロシージャには、高純度、均一酵素体外酵素と阻害アッセイ、適した質量²³、および構造決定²⁴によって詳細なプロテオーム解析が得られます。浄化のプロトコルと F₁の知識-atp アーゼ構造の原子レベルが低分子阻害剤を識別し、アフリカの trypanosomiases の新薬の開発を支援する画面をデザインする可能性を開きます。さらに、プロトコルが F₁を浄化するために合わせることができる-他の生物から atp アーゼ。