Vitro Farklılaşma fare granülosit-makrofaj-koloni uyarıcı faktör (GM-CSF)-T yardımcı (THGM) hücreleri üreten
Summary
Burada, fare granulocyte-macrophage-colony-stimulating-factor-producing T yardımcı (THGM) hücreleri yalıtım saf CD4 + T hücreleri, THGM, farklılaşma da dahil olmak üzere saf CD4 + T hücrelerden ayırt etmek için bir iletişim kuralı mevcut ve farklılaştırılmış THGM hücre analizi. Bu yöntem çalışmaları Yönetmeliğin ve THGM hücre işlevi uygulanır.
Abstract
Granülosit-makrofaj-koloni uyarıcı faktör (GM-CSF)-T yardımcı (THGM) hücresi üretim ağırlıklı olarak interferon (IFN) γ veya interlökin (IL) -17 üretmeden GM-CSF salgılar ve için bulunan yeni saptanan bir T yardımcı hücresi alt budur otoimmün neuroinflammation önemli bir rol oynamaktadır. Bir yöntem tecrit splenocytes bir tek hücreli askıya saf CD4 + T hücreleri ve THGM hücre üretimi saf CD4 + T hücreleri, T hücre-aracılı bağışıklık ve otoimmün hastalıklar içinde yararlı bir yöntem olacaktır. Burada THGM hücrelere IL-7 tarafından terfi fare saf CD4 + T hücreleri ayırır yöntemi açıklanmaktadır. Farklılaşma sonucu hücre içi sitokin akış sitometresi ile bir nicel gerçek zamanlı polimeraz zincir tepkimesi (PCR), kombine boyama da dahil olmak üzere farklı yöntemlerle sitokinler ifade analizi tarafından değerlendirildi ve enzim bağlı immunosorbent deneyleri (ELISA). THGM farklılaşma Protokolü burada açıklandığı gibi kullanarak, hücreleri yaklaşık % 55’i IFNα veya IL-17 en az bir ifade ile GM-CSF ifade. GM-CSF THGM hücreleri tarafından baskın ifade daha fazla GM-CSF, IFNα ve IL-17 mRNA ve protein düzeylerinde ifade analizi tarafından doğrulandı. Böylece, bu yöntem saf CD4 + T hücreleri t ayırt etmek için kullanılabilirHGM hücreleri vitro, hangi THGM hücre biyolojisi çalışmada yararlı olacak.
Introduction
CD4 + T yardımcı (TH) hücreleri mikrobiyal patojenler karşı ana savunma, kanser gözetim ve otoimmünite1,2,3çok önemli rolleri olan bağışıklık sisteminin temel bileşenleridir. T hücre reseptör (TCR) etkinleştirme, üzerine saf CD4 + T hücreleri TH1, TH2 farklılaşmış, TH 17 veya düzenleyici T (Treg) farklı sitokin ni2,4, etkisi altında hücreleri. 5. son zamanlarda, ağırlıklı olarak GM-CSF üreten yeni hücre alt grubunu TH , tespit ve THGM6adında. THGM hücrelere farklılaşma sinyal dönüştürücü aktivasyonu ve bir aktivatör transkripsiyon 5 (STAT5) IL-7 tarafından tahrik edilmektedir. Bu hücreler diğer THdüşük bir ifade yaparken GM-CSF büyük miktarda hızlı-IFNγ ve IL-176gibi imza sitokinler hücre. GM-CSF CD4 + T hücre-aracılı neuroinflammation7,8gelişiminde önemli bir rol oynamaya bulundu. IFNγ – veya IL-17-ifade autoreactive T hücrelere kıyasla, GM-CSF-ifade T bir önceki hastalığı başlangıçlı ve daha yüksek hastalık şiddeti neden vahşi-türüne aktarılan (WT) fare hücreleri. IFNγ veya IL-17A eksik T hücreleri EAE7aracılık yeteneğini muhafaza, ancak buna ek olarak, Csf2– / – T hücreleri deneysel otoimmun ensefalomiyelit (EAE) ikna etmek WT alıcıya aktarılan adoptively sonra başarısız oldu. Ayrıca, GM-CSF nötralize antikorları kullanarak bir abluka EAE hastalık şiddeti8iyileştirmiştir. Ayrıca, STAT5 T hücrelerin farelerde eksikliği azalmış THGM üretimi ve bu nedenle, bir direnç farelerin EAE geliştirme6‘ sonuçlandı. Bu bulgular önemini GM-CSF-ifade TH hücre otoimmün neuroinflammatory hastalığında altını çiziyor. Böylece, saf CD4 + T hücreleri GM-CSF-ifade TH hücrelerden ayırt etmek için bir yöntem oluşturma otoimmün neuroinflammation ve T hücre-aracılı bağışıklık yanıtı patogenezinde çalışmada önemli olacaktır. Ancak, bir protokol bu verimli THGM hücreleri fare saf kurulmuştur CD4 + değil oluşturur.
Burada saf CD4 + T hücreleri fare THGM hücrelerden ayırır bir yöntem mevcut. Bu iletişim kuralı fareden dalak çıkarma, bir tek hücre süspansiyon, CD4 pozitif seçim, floresans aktif hücre (FACS) sıralama ve TH hücre hazırlanması da dahil olmak üzere tüm yordamı açıklar farklılaşma ve analiz. Farklılaştırılmış T yardımcı hücreleri tek hücre düzeyinde sitokin ifade mRNA düzeyinde belirlemek için nicel bir gerçek zamanlı PCR tarafından sitokin ifade belirlemek için akış sitometresi ile kombine boyama hücre içi sitokin tarafından incelenir ve protein düzeyinde sitokin ifade değerlendirmek için ELISA tarafından. Bu yöntem THGM hücre biyolojisi EAE, nerede GM-CSF patogenezinde önemli bir rol oynar gibi çeşitli koşullarda çalışmaları uygulanabilir.
Protocol
Representative Results
Discussion
Burada bir iletişim kuralı yöntemi doğrulamak için farklılaştırılmış hücrelerin bir analizini tarafından takip fare saf CD4 + hücrelerden bir vitro THGM farklılaşma açıklanan. Not, dalak ve lenf bezleri saf CD4 + T hücre arıtma ve THGM farklılaşma için kullanılabilir. Hücre içi sitokin gösterdi ki hücreler yaklaşık % 55’i akış sitometresi ile kombine boyama tarafından belirlenen sitokin ifade indüklenen GM-CSF-ifade hücreleri (Şekil 1…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Bu çalışmada Singapur Ulusal Üniversitesi Sağlık sistemi (T1-2014 Ekim-12 ve T1-2015 Eylül-10) gelen hibe tarafından desteklenmiştir.
Materials
| RPMI 1640 | Biowest | L0500-500 | |
| FBS Heat Inactivated | Capricorn | FBS-HI-12A | |
| Penicillin-Streptomycin | Gibco | 15140122 | |
| 10x PBS | 1st Base | BUF-2040-10 | Diluted to 1x PBS in sterile water |
| EDTA | 1st Base | BUF-1053-100ml-pH8.0 | |
| 10X ACK buffer | Biolegend | 420301 | diluted in sterile water |
| cell strainer | SPL Life Sciences | 93070 | |
| CD4 microbeads | Miltenyi Biotec | 130-049-201 | |
| 2-Mercaptoethanol | Sigma | M7522 | |
| LS column | Miltenyi Biotec | 130-042-401 | |
| magnetic stand | Miltenyi Biotec | 130-042-303 | |
| 1ml syringe | Terumo | SS+01T | |
| Centrifuge | Eppendorf | Eppendorf 5810R | |
| Sony SY3200 cell sorter | Sony | Sony SY3200 cell sorter | |
| 50ml conical centrifuge tube | Greiner Bio-One | 210261 | |
| 15m conical centrifuge tube | Greiner Bio-One | 188271 | |
| FACS tube | Corning | 352054 | |
| 24 well cell culture plate | Greiner Bio-One | 662160 | |
| anti-mouse CD4 PerCP-eFluor 710 | eBioscience | 46-0041-82 | |
| PE conjugated anti-mouse CD25 (IL-2Ra, p55) | eBioscience | 12-0251-82 | |
| anti-human/mouse CD44 APC | eBioscience | 17-0441-82 | |
| anti-mouse CD62L FITC | eBioscience | 11-0621-85 | |
| Neubauer-improved counting chamber | Marienfeld | 640010 | |
| Hyclone Trypan Blue Solution | GE healthcare Life Sciences | SV30084.01 | |
| microscope | Nikon | Nikon Elipse TS100 | |
| Purified anti-mouse CD3e antibody | Biolegend | 100314 | |
| Purified hamster anti-mouse CD28 | BD Biosciences | 553295 | |
| Purified Rat anti-mouse IFNγ | eBioscience | 16-7312-85 | |
| Purified anti-mouse IL-4 Antibody | Biolegend | 504102 | |
| Recombinant Mouse IL-7 Protein | R&D system | 407-ML | |
| Recombinant Mouse IL-6 | R&D system | 406‑ML | |
| recombinant human TGF-beta | R&D system | 240-B-010 | |
| PMA | Merck Millipore | 19-144 | |
| Ionomycin | Sigma | I0634 | |
| GolgiPlug protein transport inhibitor | BD Biosciences | 51-2301KZ | |
| Intracellular Fixation&Permeabilization buffer set | eBioscience | 88-8824-00 | |
| anti-mouse GM-CSF PE | eBioscience | 12-7331-82 | |
| FITC anti-mouse IL-17A | Biolegend | 506908 | |
| APC anti-mouse IFN-gamma | Biolegend | 505810 | |
| GO Taq qPCR master mix | Promega | A6002 | |
| mouse GM-CSF ELISA Ready-SET-Go! | invitrogen | 88-7334-88 | |
| Mouse IL-17A Uncouted ELISA | invitrogen | 88-7371-22 |
References
- Zhu, J., Paul, W. E. CD4 T cells: fates, functions, and faults. Blood. 112, 1557-1569 (2008).
- Kara, E. E., et al. Tailored immune responses: novel effector helper T cell subsets in protective immunity. PLoS Pathogens. 10, e1003905 (2014).
- Bou Nasser Eddine, F., Ramia, E., Tosi, G., Forlani, G., Accolla, R. S. Tumor Immunology meets…Immunology: Modified cancer cells as professional APC for priming naive tumor-specific CD4+ T cells. Oncoimmunology. 6, e1356149 (2017).
- Dong, C. TH17 cells in development: an updated view of their molecular identity and genetic programming. Nature Reviews. Immunology. 8, 337-348 (2008).
- Korn, T., Bettelli, E., Oukka, M., Kuchroo, V. K. IL-17 and Th17 Cells. Annual Review of Immunology. 27, 485-517 (2009).
- Sheng, W., et al. STAT5 programs a distinct subset of GM-CSF-producing T helper cells that is essential for autoimmune neuroinflammation. Cell Research. 24, 1387-1402 (2014).
- Codarri, L., et al. RORgammat drives production of the cytokine GM-CSF in helper T cells, which is essential for the effector phase of autoimmune neuroinflammation. Nature Immunology. 12, 560-567 (2011).
- El-Behi, M., et al. The encephalitogenicity of T(H)17 cells is dependent on IL-1- and IL-23-induced production of the cytokine GM-CSF. Nature Immunology. 12, 568-575 (2011).
- Ivanov, I. I., et al. The orphan nuclear receptor RORgammat directs the differentiation program of proinflammatory IL-17+ T helper cells. Cell. 126, 1121-1133 (2006).
- Zhang, J., et al. A novel subset of helper T cells promotes immune responses by secreting GM-CSF. Cell Death and Differentiation. 20, 1731-1741 (2013).
- Croxford, A. L., Spath, S., Becher, B. GM-CSF in Neuroinflammation: Licensing Myeloid Cells for Tissue Damage. Trends in Immunology. 36, 651-662 (2015).
