In Vitro Diferenciación del Factor del Granulocyte-macrófago-estimulante de colonias (GM-CSF) de ratón-producción de linfocitos de T (T_HGM)

De células T CD4 + helper (T_H) son componentes esenciales del sistema inmune, teniendo papeles cruciales en la defensa del huésped frente a patógenos microbianos, en la vigilancia del cáncer y autoinmunidad^1,2,3. Sobre la activación de células T del receptor (TCR), ingenuo de células T CD4 + se pueden distinguir en T_H1, T_H2, T_H , reglamentarios o de 17 células de T (Treg) bajo la influencia de citocinas diferentes ambientes^{2,4, 5}. recientemente, un nuevo subconjunto de células T_H , que principalmente produce el GM-CSF, se identificó y nombró T_HGM⁶. La diferenciación de las células T_HGM es conducida por IL-7 a través de la activación de un transductor de señal y activador de la transcripción 5 (STAT5). Estas células expresan una gran cantidad de GM-CSF al mismo tiempo que una baja expresión de otros T_H-célula citocinas firma como IFNγ y la IL-17⁶. GM-CSF fue encontrado para desempeñar un papel crítico en el desarrollo de CD4 + neuroinflamación mediada por células T^7,8. En comparación con las células autorreactivas T expresa IFNγ o con IL-17, GM-CSF-expresar T células transferido a tipo salvaje ratones (WT) causadas un inicio anterior de la enfermedad y mayor severidad de la enfermedad. Además, Csf2– / – células de T no pudieron inducir la encefalomielitis autoinmune experimental (EAE) después siendo transferido eventualmente a los destinatarios de la WT, mientras que las células T carente de IFNγ, IL-17A o retenido la capacidad de mediar EAE⁷. Por otra parte, un bloqueo de GM-CSF con anticuerpos neutralizantes mejoró EAE de severidad de la enfermedad⁸. Además, una deficiencia de STAT5 en células T en ratones resultó en una menor generación de T_HGM y, por tanto, en una resistencia de los ratones a EAE desarrollo⁶. Estos resultados subrayan la importancia de las células de T de GM-CSF-expresando_H en enfermedad autoinmune capensis. Por lo tanto, establecer un método para distinguir las células de T de GM-CSF-expresando_H de células T CD4 + de ingenuo sería importante en el estudio de la patogenia autoinmune neuroinflamación y la respuesta inmune mediada por células T. Sin embargo, un protocolo eficientemente genera células T_HGM de murino ingenuo que CD4 + no ha sido establecida.

Aquí presentamos un método que distingue las células de T_HGM murinas de células T CD4 + de ingenuo. Este protocolo describe el procedimiento entero, incluyendo la extracción del bazo de ratón, la preparación de una suspensión unicelular, la selección positiva de CD4, la célula activada por fluorescencia (FACS) de clasificación y la célula de T_H diferenciación y análisis. Las T helper células diferenciadas, son analizadas por citoquinas intracelulares tinción combinada con citometría de flujo para determinar la expresión de citocinas a nivel unicelular, de una PCR cuantitativa en tiempo real para determinar la expresión de citoquinas a nivel de mRNA, y por ELISA para evaluar la expresión de citoquinas a nivel de la proteína. Este método puede ser aplicado a los estudios de Biología de la célula de T_HGM bajo varias condiciones, tales como EAE, donde GM-CSF juega un papel importante en la patogenesia.