In-vitro- Differenzierung von Granulozyten-Makrophagen-Kolonie-stimulierende Faktor (GM-CSF) Maus-Herstellung von T-Helferzellen (T_HGM)

CD4 + T-Helferzellen (T_H) sind wesentliche Bestandteile des Immunsystems, da entscheidende Rollen in der Wirt Verteidigung gegen mikrobielle Krankheitserreger, in der Krebs-Überwachung, und Autoimmunität^1,2,3. Bei der T-Zell-Rezeptor (TCR) Aktivierung naive CD4 + T-Zellen differenzieren sich in T_H1, T_H2, T_H 17 oder regulatorischen T (Treg) Zellen unter dem Einfluss von verschiedenen Zytokin Milieus^{2,4, 5}. vor kurzem eine neue Untergruppe von T_H Zellen, die überwiegend GM-CSF produziert, wurde identifiziert und benannt T_HGM⁶. Die Differenzierung der Zellen T_HGM treibt IL-7 durch die Aktivierung von einem Signalwandler und Aktivator der Transkription 5 (STAT5). Diese Zellen eine große Menge von GM-CSF zum Ausdruck bringen und dabei eine geringe Expression von anderen T-_H-Handy-Signatur Zytokine wie z. B. IFNγ und IL-17⁶. GM-CSF erwies sich als eine entscheidende Rolle bei der Entwicklung von CD4 + T-Zell-vermittelten Neuroinflammation^7,8. GM-CSF mit dem Ausdruck T Zellen im Vergleich zu IFNγ oder IL-17-exprimierenden autoreaktiven T-Zellen, in Wildtyp übertragen (WT) Mäusen verursacht ein früher Krankheitsbeginn und höheren Schweregrad der Erkrankung. Darüber hinaus scheiterte Csf2– / – T-Zellen induzieren Experimentelle autoimmune Enzephalomyelitis (EAE) nach adoptively auf WT-Empfänger übertragen werden, während T-Zellen IFNγ oder IL-17A fehlt die Fähigkeit, EAE⁷vermitteln beibehalten. Darüber hinaus verbessert eine Blockade von GM-CSF mit neutralisierenden Antikörpern EAE Krankheit schwere⁸. Darüber hinaus führte ein Mangel an STAT5 in T-Zellen in Mäusen in einer verminderten T_HGM-Generation und somit in einen Widerstand von den Mäusen EAE Entwicklung⁶. Diese Ergebnisse unterstreichen die Bedeutung von GM-CSF mit dem Ausdruck T_H Zellen in autoimmune schwere Krankheit. So wäre eine Methode um GM-CSF mit dem Ausdruck T_H Zellen von naiven CD4 + T-Zellen zu unterscheiden in der Untersuchung der Pathogenese von Autoimmunerkrankungen Neuroinflammation und T-Zell-vermittelten Immunantwort wichtig. Allerdings erzeugt ein Protokoll, das effizient T_HGM Zellen aus murinen naive CD4 + nicht etabliert hat.

Hier präsentieren wir eine Methode, die naive CD4 + T-Zellen murine T_HGM Zellen unterscheidet. Dieses Protokoll beschreibt das gesamte Verfahren, einschließlich der Entnahme der Milz von der Maus, die Vorbereitung eine einzellige Suspension, die CD4 positive Selektion, die Fluoreszenz-aktivierte Zelle Sortieren (FACS) und die T_H Zelle Differenzierung und Analyse. Die differenzierte T-Helferzellen werden analysiert, indem intrazellulären Zytokin Färbung kombiniert mit Durchflusszytometrie zu bestimmen, die Cytokine Ausdruck Ebene einzellige durch eine quantitative Echtzeit-PCR die Zytokin-Expression auf mRNA-Ebene zu bestimmen und von ELISA die Zytokin-Expression auf proteinebene zu bewerten. Diese Methode kann auf Studien von T_HGM Zellbiologie unter verschiedenen Bedingungen, wie z. B. EAE, angewendet werden, wo GM-CSF eine wichtige Rolle in der Pathogenese spielt.