В пробирке Дифференциация мыши гранулоцитарно макрофагального колониестимулирующий фактор (ГМ КСФ)-производящ клетки T вспомогательный (THGM)
Summary
Здесь мы представляем протокол дифференцировать мышиных granulocyte-macrophage-colony-stimulating-factor-producing T (THGM) хелперы из клеток CD4 + T наивно, включая изоляции наивно CD4 + Т-клеток, дифференциация THGM, и анализ дифференцированных клеток THGM. Этот метод может применяться для изучения положения и функции клеток THGM.
Abstract
Гранулоцитарно макрофагальный колониестимулирующий фактор (ГМ-КСФ)-производство клеток T вспомогательный (THGM) является подмножеством недавно выявленных вспомогательные клетки T, что преимущественно выделяет ГМ-КСФ без производства Гамма интерферон (ИФН) или интерлейкина (IL) -17 и оказывается играть важную роль в аутоиммунных neuroinflammation. Метод изоляции клеток CD4 + T наивно от одноклеточного приостановления splenocytes и поколения клетки THGM от наивного CD4 + Т-клеток было бы полезным методом в исследовании T клеточный иммунитет и аутоиммунных заболеваний. Здесь мы описываем метод, который отличает мыши наивно CD4 + Т-клеток в клетки THGM, пропагандируемые IL-7. Итоги дифференциация оценивалась путем анализа выражения цитокинов, с использованием различных методов, включая внутриклеточных цитокинов, пятнать в сочетании с проточной цитометрии, количественных реального времени полимеразной цепной реакции (ПЦР), и энзим соединенный иммуноферментного анализа (ИФА). Используя протокол дифференциация THGM как описано здесь, около 55% клеток выразил ГМ-КСФ с минимальным выражением IFNα или ил-17. Преобладающим выражение ГМ-КСФ клетками THGM далее подтверждается анализ экспрессии и ГМ-КСФ, IFNα, Ил-17 уровня мРНК и белка. Таким образом, этот метод может использоваться для различения наивно клеток CD4 + T THGM клеток в пробирке, которые будут полезны в изучении биологии клетки THGM.
Introduction
Хелперы CD4 + T (TH) являются важнейшими компонентами иммунной системы, что решающую роль в принимающей обороны против патогенных микроорганизмов, наблюдения рак и аутоиммунные заболевания1,2,3. После активации клеток T рецептор (TCR) наивно CD4 + Т-клеток могут быть дифференцированы в TH1, T 2H, TH 17, или регулирования T (Treg) клеток под влиянием различных цитокинов кругах2,4, 5. Недавно, новый подмножество клеток TH , который преимущественно производит ГМ-КСФ, определены и назвал THGM6. Дифференцировка клеток THGM обусловлено IL-7 путем активации сигнала датчика и активатор транскрипции 5 (STAT5). Эти клетки выразить большое количество ГМ-КСФ имея низкий выражение других TH-клетки подпись цитокинов, таких как IFNγ и IL-176. Было установлено, что ГМ-КСФ играть решающую роль в развитии CD4 + Т клеток опосредованной neuroinflammation7,8. По сравнению с IFNγ – или ил-17-выражая аутореактивная Т-клеток, ГМ-КСФ выражая T клетки передана одичал тип (WT) мышей вызвало ранее заболевания и более высокой тяжести заболевания. Кроме того клетки T Csf2– / – не побудить Экспериментальный аутоиммунный энцефаломиелит (EAE) после восприимчивую передается WT получателям, тогда как Т-клетки, не хватает IFNγ или ил 17а сохранили способность посредником ЕАЕ7. Кроме того блокада ГМ-КСФ использование нейтрализующих антител смягчены ЕАЕ болезни тяжести8. Кроме того дефицит STAT5 в Т-клетки мышей привело в уменьшилось поколения THGM и, следовательно, сопротивление мышей ЕАЕ развития6. Эти выводы подчеркивают важность ГМ-КСФ выражая TH клеток в neuroinflammatory аутоиммунных заболеваний. Таким образом установление метода дифференцировать ГМ-КСФ выражая TH клетки от наивного CD4 + Т-клеток было бы важно в изучении патогенеза аутоиммунного neuroinflammation и T клеточного иммунного ответа. Однако протокол, эффективно создает THGM клетки из мышиных наивен, что CD4 + установлено не было.
Здесь мы представляем метод, который отличает мышиных THGM клетки от наивного CD4 + Т-клеток. Этот протокол описывает всю процедуру, включая извлечение хандры от мыши, подготовка одноклеточных подвеска, выбор положительный CD4, активируемых флуоресценции клеток, сортируя (FACS) и клеток TH дифференциация и анализа. Дифференцированные Т-хелперы анализируются внутриклеточных цитокинов, пятнать в сочетании с проточной цитометрии определить выражение cytokine на уровне одной ячейки, Количественная ПЦР в реальном времени чтобы определить выражение cytokine на уровне мРНК, и по ELISA оценить выражение cytokine уровня белка. Этот метод может применяться для исследования биологии клетки THGM в различных условиях, таких как ЕАЕ, где ГМ-КСФ играет важную роль в патогенезе.
Protocol
Representative Results
Discussion
Здесь мы описали протокол в vitro THGM дифференциации от мыши наивно CD4 + клеток, следуют анализ дифференцированных клеток для проверки метода. Следует отметить селезенке и лимфатических узлах может использоваться для наивного CD4 + Т-клеток очистки и THGM дифференциации. Выраж…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Это исследование было поддержано субсидий из национального университета здравоохранения системы Сингапура (T1-2014-Окт-12 и 10 сентября T1-2015).
Materials
| RPMI 1640 | Biowest | L0500-500 | |
| FBS Heat Inactivated | Capricorn | FBS-HI-12A | |
| Penicillin-Streptomycin | Gibco | 15140122 | |
| 10x PBS | 1st Base | BUF-2040-10 | Diluted to 1x PBS in sterile water |
| EDTA | 1st Base | BUF-1053-100ml-pH8.0 | |
| 10X ACK buffer | Biolegend | 420301 | diluted in sterile water |
| cell strainer | SPL Life Sciences | 93070 | |
| CD4 microbeads | Miltenyi Biotec | 130-049-201 | |
| 2-Mercaptoethanol | Sigma | M7522 | |
| LS column | Miltenyi Biotec | 130-042-401 | |
| magnetic stand | Miltenyi Biotec | 130-042-303 | |
| 1ml syringe | Terumo | SS+01T | |
| Centrifuge | Eppendorf | Eppendorf 5810R | |
| Sony SY3200 cell sorter | Sony | Sony SY3200 cell sorter | |
| 50ml conical centrifuge tube | Greiner Bio-One | 210261 | |
| 15m conical centrifuge tube | Greiner Bio-One | 188271 | |
| FACS tube | Corning | 352054 | |
| 24 well cell culture plate | Greiner Bio-One | 662160 | |
| anti-mouse CD4 PerCP-eFluor 710 | eBioscience | 46-0041-82 | |
| PE conjugated anti-mouse CD25 (IL-2Ra, p55) | eBioscience | 12-0251-82 | |
| anti-human/mouse CD44 APC | eBioscience | 17-0441-82 | |
| anti-mouse CD62L FITC | eBioscience | 11-0621-85 | |
| Neubauer-improved counting chamber | Marienfeld | 640010 | |
| Hyclone Trypan Blue Solution | GE healthcare Life Sciences | SV30084.01 | |
| microscope | Nikon | Nikon Elipse TS100 | |
| Purified anti-mouse CD3e antibody | Biolegend | 100314 | |
| Purified hamster anti-mouse CD28 | BD Biosciences | 553295 | |
| Purified Rat anti-mouse IFNγ | eBioscience | 16-7312-85 | |
| Purified anti-mouse IL-4 Antibody | Biolegend | 504102 | |
| Recombinant Mouse IL-7 Protein | R&D system | 407-ML | |
| Recombinant Mouse IL-6 | R&D system | 406‑ML | |
| recombinant human TGF-beta | R&D system | 240-B-010 | |
| PMA | Merck Millipore | 19-144 | |
| Ionomycin | Sigma | I0634 | |
| GolgiPlug protein transport inhibitor | BD Biosciences | 51-2301KZ | |
| Intracellular Fixation&Permeabilization buffer set | eBioscience | 88-8824-00 | |
| anti-mouse GM-CSF PE | eBioscience | 12-7331-82 | |
| FITC anti-mouse IL-17A | Biolegend | 506908 | |
| APC anti-mouse IFN-gamma | Biolegend | 505810 | |
| GO Taq qPCR master mix | Promega | A6002 | |
| mouse GM-CSF ELISA Ready-SET-Go! | invitrogen | 88-7334-88 | |
| Mouse IL-17A Uncouted ELISA | invitrogen | 88-7371-22 |
References
- Zhu, J., Paul, W. E. CD4 T cells: fates, functions, and faults. Blood. 112, 1557-1569 (2008).
- Kara, E. E., et al. Tailored immune responses: novel effector helper T cell subsets in protective immunity. PLoS Pathogens. 10, e1003905 (2014).
- Bou Nasser Eddine, F., Ramia, E., Tosi, G., Forlani, G., Accolla, R. S. Tumor Immunology meets…Immunology: Modified cancer cells as professional APC for priming naive tumor-specific CD4+ T cells. Oncoimmunology. 6, e1356149 (2017).
- Dong, C. TH17 cells in development: an updated view of their molecular identity and genetic programming. Nature Reviews. Immunology. 8, 337-348 (2008).
- Korn, T., Bettelli, E., Oukka, M., Kuchroo, V. K. IL-17 and Th17 Cells. Annual Review of Immunology. 27, 485-517 (2009).
- Sheng, W., et al. STAT5 programs a distinct subset of GM-CSF-producing T helper cells that is essential for autoimmune neuroinflammation. Cell Research. 24, 1387-1402 (2014).
- Codarri, L., et al. RORgammat drives production of the cytokine GM-CSF in helper T cells, which is essential for the effector phase of autoimmune neuroinflammation. Nature Immunology. 12, 560-567 (2011).
- El-Behi, M., et al. The encephalitogenicity of T(H)17 cells is dependent on IL-1- and IL-23-induced production of the cytokine GM-CSF. Nature Immunology. 12, 568-575 (2011).
- Ivanov, I. I., et al. The orphan nuclear receptor RORgammat directs the differentiation program of proinflammatory IL-17+ T helper cells. Cell. 126, 1121-1133 (2006).
- Zhang, J., et al. A novel subset of helper T cells promotes immune responses by secreting GM-CSF. Cell Death and Differentiation. 20, 1731-1741 (2013).
- Croxford, A. L., Spath, S., Becher, B. GM-CSF in Neuroinflammation: Licensing Myeloid Cells for Tissue Damage. Trends in Immunology. 36, 651-662 (2015).
