Summary

In Vitro Differentiatie van muis granulocyt-macrofaag-kolonie-stimulerende Factor (GM-CSF)-produceren van T-Helper (THGM) cellen

Published: September 10, 2018
doi:

Summary

Hier presenteren we een protocol te differentiëren lymfkliertest granulocyte-macrophage-colony-stimulating-factor-producing T-helper (THGM) cellen van naïef CD4 + T-cellen, met inbegrip van isolatie van naïeve CD4 + T cellen, differentiatie van THGM, en analyse van gedifferentieerde THGM cellen. Deze methode kan worden toegepast op de studies van de verordening en de functie van THGM cellen.

Abstract

De granulocyt-macrofaag-kolonie-stimulerende factor (GM-CSF)-produceren van T-helper (THGM)-cel is een nieuw geïdentificeerde T helper cel deelverzameling die overwegend scheidt van GM-CSF zonder het produceren van interferon (IFN) γ of Interleukine (IL)-17 en komt tot spelen een essentiële rol in de auto-immune neuroinflammation. Een methode van isolatie van naïeve CD4 + T cellen van een eencellige opschorting van splenocytes en THGM cel generatie uit naïef CD4 + T cellen zou een nuttige techniek in de studie van T-cel-gemedieerde immuniteit en auto-immune ziekten. Hier beschrijven we een methode die muis naïef CD4 + T cellen in THGM cellen bevorderd door IL-7 onderscheidt. Het resultaat van de differentiatie werd beoordeeld door de analyse van de cytokines expressie met behulp van verschillende technieken, met inbegrip van intracellulaire cytokine kleuring gecombineerd met stroom cytometry, een kwantitatieve real-time polymerasekettingreactie (PCR), en Enzyme-linked immunosorbent assays (ELISA). Met behulp van de THGM differentiatie protocol zoals beschreven hier, ongeveer 55% van de cellen uitgedrukt GM-CSF met een minimale uiting van IFNα of IL-17. De overheersende uitdrukking van GM-CSF door THGM cellen werd verder bevestigd door de analyse van de uitdrukking van GM-CSF, IFNα en IL-17 op zowel eiwitten als mRNA niveaus. Dus, deze methode kan worden gebruikt om te onderscheiden van de naïeve CD4 + T cellen aan THGM cellen in vitro, die nuttig zal zijn in de studie van biologie van de cel van de THGM.

Introduction

CD4 + T-helper (TH) cellen zijn essentiële onderdelen van het immune systeem, cruciale rol in de verdediging van de gastheer tegen microbiële ziekteverwekkers, in kanker toezicht, en autoimmuniteit1,2,3. Na activatie van T-cel receptor (TCR), naïef CD4 + T cellen kunnen worden onderscheiden in TH1, TH2, TH 17, of regelgevende T (Walter) cellen onder de invloed van verschillende cytokine milieus2,4, 5. onlangs een nieuwe subset van TH cellen, die overwegend GM-CSF produceert, werd geïdentificeerd en THGM6genoemd. De differentiatie van THGM cellen wordt gedreven door IL-7 door middel van de activering van een signaal transducer en een activator van transcriptie 5 (STAT5). Deze cellen een grote hoeveelheid GM-CSF express terwijl het hebben van een lage uitdrukking van andere TH-cell handtekening cytokines zoals IFNγ en IL-176. GM-CSF bleek te spelen een cruciale rol in de ontwikkeling van CD4 + T cellen gemedieerde neuroinflammation7,8. In vergelijking met IFNγ – of IL-17-uiting van autoreactieve T cellen, cellen GM-CSF-uiting van T overgedragen naar wild-type (WT) muizen veroorzaakt een eerdere ziekte en de hogere ziekte-ernst. Daarnaast mislukte Csf2– / – T-cellen voor het opwekken van experimentele autoimmune encefalomyelitis (EAE) na wordt adoptively doorgegeven aan ontvangers die WT, overwegende dat T-cellen ontbreekt IFNγ of IL-17A behouden de mogelijkheid om te bemiddelen EAE7. Bovendien, een blokkade van GM-CSF met behulp van neutraliserende antilichamen verbeterd EAE ziekte ernst8. Bovendien, een tekort aan STAT5 in T-cellen in muizen resulteerde in een verminderde THGM-generatie en, vandaar, een weerstand van de muizen EAE ontwikkeling6. Deze bevindingen onderstrepen het belang van GM-CSF-uiten TH cellen in auto-immune neuroinflammatoire ziekte. Dus, tot vaststelling van een methode om te differentiëren van GM-CSF-uiten TH cellen van naïeve CD4 + T cellen zou belangrijk in de studie van de pathogenese van auto-immune neuroinflammation en T cel-gemedieerde immuun reacties. Echter, een protocol dat efficiënt hervormt THGM cellen lymfkliertest naïef die CD4 + is niet vastgesteld.

Hier presenteren we een methode die lymfkliertest THGM cellen uit naïef CD4 + T cellen onderscheidt. Dit protocol beschrijft de hele procedure, met inbegrip van de winning van de milt van de muis, de voorbereiding van een eencellige schorsing, de CD4-positieve selectie, de fluorescentie-activated cell sorting (FACS) en de cel TH differentiatie en analyse. De gedifferentieerde T-helper cellen worden geanalyseerd door intracellulaire cytokine kleuring gecombineerd met stroom cytometry om te bepalen van de cytokine-expressie op het niveau van eencellige, door een kwantitatieve PCR in real time om te bepalen van de expressie van cytokine mRNA niveau, en door ELISA te beoordelen van de cytokine-expressie op het niveau van de eiwitten. Deze methode kan worden toegepast op de studies van de biologie van de cel van THGM onder verschillende omstandigheden, zoals EAE, waar GM-CSF een belangrijke rol in de pathogenese speelt.

Protocol

Alle muizen gebruikt in dit protocol werden op de genetische achtergrond van C57BL/6 en gehuisvest onder specifieke pathogenen vrije voorwaarden aan de nationale universiteit van Singapore. Alle experimenten werden uitgevoerd met behulp van protocollen die zijn goedgekeurd door de institutionele Animal Care en gebruik van het Comité van de nationale universiteit van Singapore. 1. reagens en materiële voorbereiding Het bereiden van 500 mL met fosfaat gebufferde zoutoplossing (PBS) m…

Representative Results

Naïeve CD4 + T cellen geïsoleerd uit twee 8-week-oude mannelijke C57BL/6 muizen werden verdeeld in drie gedeelten. Een deel van de cellen werd onderscheid gemaakt tussen THGM cellen volgens het protocol beschreven. Een ander gedeelte werd gekweekt onder de voorwaarde van een THGM in aanwezigheid van anti-IL-4 antilichaam (10 µg/mL) als u wilt testen van de invloed van een blokkade van de IL-4 bij de differentiatie van THGM. Het laatste gedeelte werd gek…

Discussion

We beschreven hier een protocol van een in vitro THGM differentiatie van muis naïef CD4 +-cellen, gevolgd door een analyse van de gedifferentieerde cellen voor het valideren van de methode. Opmerking, kan zowel de milt en de lymfeklieren worden aangewend voor naïef CD4 + T cel zuivering en THGM differentiatie. De cytokine-expressie bepaald door intracellulaire cytokine kleuring gecombineerd met stroom cytometry bleek dat ongeveer 55% van de cellen werden aangezet tot GM-CSF-uiting van cel…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Deze studie werd ondersteund door subsidies van de nationale universiteit gezondheid systeem van Singapore (T1-2014 okt-12 en T1-2015 Sep-10).

Materials

RPMI 1640 Biowest L0500-500
FBS Heat Inactivated Capricorn FBS-HI-12A
Penicillin-Streptomycin Gibco 15140122
10x PBS 1st Base BUF-2040-10 Diluted to 1x PBS in sterile water
EDTA 1st Base BUF-1053-100ml-pH8.0
10X ACK buffer Biolegend 420301 diluted in sterile water
cell strainer SPL Life Sciences 93070
CD4 microbeads Miltenyi Biotec 130-049-201
2-Mercaptoethanol Sigma M7522
LS column Miltenyi Biotec 130-042-401
magnetic stand Miltenyi Biotec 130-042-303
1ml syringe Terumo SS+01T
Centrifuge Eppendorf Eppendorf 5810R
Sony SY3200 cell sorter Sony Sony SY3200 cell sorter
50ml conical centrifuge tube Greiner Bio-One 210261
15m conical centrifuge tube Greiner Bio-One 188271
FACS tube Corning 352054
24 well cell culture plate Greiner Bio-One 662160
anti-mouse CD4 PerCP-eFluor 710 eBioscience 46-0041-82
PE conjugated anti-mouse CD25 (IL-2Ra, p55) eBioscience 12-0251-82
anti-human/mouse CD44 APC eBioscience 17-0441-82
anti-mouse CD62L FITC eBioscience 11-0621-85
Neubauer-improved counting chamber Marienfeld 640010
Hyclone Trypan Blue Solution GE healthcare Life Sciences SV30084.01
microscope Nikon Nikon Elipse TS100
Purified anti-mouse CD3e antibody Biolegend 100314
Purified hamster anti-mouse CD28 BD Biosciences 553295
Purified Rat anti-mouse IFNγ   eBioscience 16-7312-85
Purified anti-mouse IL-4 Antibody Biolegend 504102
Recombinant Mouse IL-7 Protein R&D system 407-ML
Recombinant Mouse IL-6 R&D system 406‑ML
recombinant human TGF-beta R&D system 240-B-010
PMA Merck Millipore 19-144
Ionomycin Sigma I0634
GolgiPlug protein transport inhibitor BD Biosciences 51-2301KZ
Intracellular Fixation&Permeabilization buffer set eBioscience 88-8824-00
anti-mouse GM-CSF PE eBioscience 12-7331-82
FITC anti-mouse IL-17A Biolegend 506908
APC anti-mouse IFN-gamma Biolegend 505810
GO Taq qPCR master mix Promega A6002
mouse GM-CSF ELISA Ready-SET-Go! invitrogen 88-7334-88
Mouse IL-17A Uncouted ELISA invitrogen 88-7371-22

References

  1. Zhu, J., Paul, W. E. CD4 T cells: fates, functions, and faults. Blood. 112, 1557-1569 (2008).
  2. Kara, E. E., et al. Tailored immune responses: novel effector helper T cell subsets in protective immunity. PLoS Pathogens. 10, e1003905 (2014).
  3. Bou Nasser Eddine, F., Ramia, E., Tosi, G., Forlani, G., Accolla, R. S. Tumor Immunology meets…Immunology: Modified cancer cells as professional APC for priming naive tumor-specific CD4+ T cells. Oncoimmunology. 6, e1356149 (2017).
  4. Dong, C. TH17 cells in development: an updated view of their molecular identity and genetic programming. Nature Reviews. Immunology. 8, 337-348 (2008).
  5. Korn, T., Bettelli, E., Oukka, M., Kuchroo, V. K. IL-17 and Th17 Cells. Annual Review of Immunology. 27, 485-517 (2009).
  6. Sheng, W., et al. STAT5 programs a distinct subset of GM-CSF-producing T helper cells that is essential for autoimmune neuroinflammation. Cell Research. 24, 1387-1402 (2014).
  7. Codarri, L., et al. RORgammat drives production of the cytokine GM-CSF in helper T cells, which is essential for the effector phase of autoimmune neuroinflammation. Nature Immunology. 12, 560-567 (2011).
  8. El-Behi, M., et al. The encephalitogenicity of T(H)17 cells is dependent on IL-1- and IL-23-induced production of the cytokine GM-CSF. Nature Immunology. 12, 568-575 (2011).
  9. Ivanov, I. I., et al. The orphan nuclear receptor RORgammat directs the differentiation program of proinflammatory IL-17+ T helper cells. Cell. 126, 1121-1133 (2006).
  10. Zhang, J., et al. A novel subset of helper T cells promotes immune responses by secreting GM-CSF. Cell Death and Differentiation. 20, 1731-1741 (2013).
  11. Croxford, A. L., Spath, S., Becher, B. GM-CSF in Neuroinflammation: Licensing Myeloid Cells for Tissue Damage. Trends in Immunology. 36, 651-662 (2015).

Play Video

Cite This Article
Lu, Y., Fu, X., Zhang, Y. In Vitro Differentiation of Mouse Granulocyte-macrophage-colony-stimulating Factor (GM-CSF)-producing T Helper (THGM) Cells. J. Vis. Exp. (139), e58087, doi:10.3791/58087 (2018).

View Video