In Vitro Differentiatie van muis granulocyt-macrofaag-kolonie-stimulerende Factor (GM-CSF)-produceren van T-Helper (T_HGM) cellen

CD4 + T-helper (T_H) cellen zijn essentiële onderdelen van het immune systeem, cruciale rol in de verdediging van de gastheer tegen microbiële ziekteverwekkers, in kanker toezicht, en autoimmuniteit^1,2,3. Na activatie van T-cel receptor (TCR), naïef CD4 + T cellen kunnen worden onderscheiden in T_H1, T_H2, T_H 17, of regelgevende T (Walter) cellen onder de invloed van verschillende cytokine milieus^{2,4, 5}. onlangs een nieuwe subset van T_H cellen, die overwegend GM-CSF produceert, werd geïdentificeerd en T_HGM⁶genoemd. De differentiatie van T_HGM cellen wordt gedreven door IL-7 door middel van de activering van een signaal transducer en een activator van transcriptie 5 (STAT5). Deze cellen een grote hoeveelheid GM-CSF express terwijl het hebben van een lage uitdrukking van andere T_H-cell handtekening cytokines zoals IFNγ en IL-17⁶. GM-CSF bleek te spelen een cruciale rol in de ontwikkeling van CD4 + T cellen gemedieerde neuroinflammation^7,8. In vergelijking met IFNγ – of IL-17-uiting van autoreactieve T cellen, cellen GM-CSF-uiting van T overgedragen naar wild-type (WT) muizen veroorzaakt een eerdere ziekte en de hogere ziekte-ernst. Daarnaast mislukte Csf2– / – T-cellen voor het opwekken van experimentele autoimmune encefalomyelitis (EAE) na wordt adoptively doorgegeven aan ontvangers die WT, overwegende dat T-cellen ontbreekt IFNγ of IL-17A behouden de mogelijkheid om te bemiddelen EAE⁷. Bovendien, een blokkade van GM-CSF met behulp van neutraliserende antilichamen verbeterd EAE ziekte ernst⁸. Bovendien, een tekort aan STAT5 in T-cellen in muizen resulteerde in een verminderde T_HGM-generatie en, vandaar, een weerstand van de muizen EAE ontwikkeling⁶. Deze bevindingen onderstrepen het belang van GM-CSF-uiten T_H cellen in auto-immune neuroinflammatoire ziekte. Dus, tot vaststelling van een methode om te differentiëren van GM-CSF-uiten T_H cellen van naïeve CD4 + T cellen zou belangrijk in de studie van de pathogenese van auto-immune neuroinflammation en T cel-gemedieerde immuun reacties. Echter, een protocol dat efficiënt hervormt T_HGM cellen lymfkliertest naïef die CD4 + is niet vastgesteld.

Hier presenteren we een methode die lymfkliertest T_HGM cellen uit naïef CD4 + T cellen onderscheidt. Dit protocol beschrijft de hele procedure, met inbegrip van de winning van de milt van de muis, de voorbereiding van een eencellige schorsing, de CD4-positieve selectie, de fluorescentie-activated cell sorting (FACS) en de cel T_H differentiatie en analyse. De gedifferentieerde T-helper cellen worden geanalyseerd door intracellulaire cytokine kleuring gecombineerd met stroom cytometry om te bepalen van de cytokine-expressie op het niveau van eencellige, door een kwantitatieve PCR in real time om te bepalen van de expressie van cytokine mRNA niveau, en door ELISA te beoordelen van de cytokine-expressie op het niveau van de eiwitten. Deze methode kan worden toegepast op de studies van de biologie van de cel van T_HGM onder verschillende omstandigheden, zoals EAE, waar GM-CSF een belangrijke rol in de pathogenese speelt.