في المختبر التفريق بين الماوس المحببات-بلعم-مستعمرة-حفز عامل (GM-CSF)-إنتاج خلايا مساعد (GMحتي) T
Summary
نقدم هنا، بروتوكولا للتفريق بين الخلايا مساعد (GMحتي) T جرانولوسيتيماكروفاجيكولونيستيمولاتينجفاكتوربرودوسينج مورين من السذاجة خلايا CD4 + T، بما في ذلك عزل من السذاجة خلايا CD4 + T، التفريق بين الآلية العالمية،حتي وو تحليل متمايزة جنرال موتورزحتي الخلايا. يمكن تطبيق هذا الأسلوب للدراسات المتعلقة بتنظيم ووظيفة خلايا تيحالآلية العالمية.
Abstract
عامل المحببات-بلعم-مستعمرة-حفز (GM-CSF)-إنتاج الخلية مساعد (GMحتي) T عبارة عن مجموعة فرعية خلية مساعد تي محددة حديثا التي يغلب عليها الطابع تفرز GM-CSF دون إنتاج الانترفيرون (IFN) γ أو انترلوكين (إيل)-17 وهو العثور على تلعب دوراً أساسيا في نيوروينفلاميشن الذاتية. وستكون وسيلة لعزل خلايا CD4 + T ساذجة من تعليق خلية واحدة من سبلينوسيتيس وجنرال موتورزحتي الجيل خلية من خلايا CD4 + T السذاجة تقنية مفيدة في دراسة الخلية T بوساطة الحصانة وأمراض المناعة الذاتية. هنا يصف لنا أسلوب الذي يميز الماوس السذاجة خلايا CD4 + T إلى خلايا تيحجنرال موتورز تعززه إيل-7. وقيمت نتائج المفاضلة بتحليل التعبير السيتوكينات باستخدام تقنيات مختلفة، بما في ذلك داخل الخلايا سيتوكين تلطيخ جنبا إلى جنب مع التدفق الخلوي، كمية في الوقت الحقيقي تفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR)، و فحوصات الممتز المرتبط بالانزيم (ELISA). استخدام بروتوكول التمايز تيحالآلية العالمية كما هو موضح هنا، أعرب حوالي 55% الخلايا GM-CSF مع تعبير الحد أدنى من IFNα أو إيل-17. وأكد التعبير السائد عن GM-CSF بخلايا تيحالآلية العالمية كذلك تحليل التعبير عن GM-CSF، و IFNα، وايل-17 على الصعيدين مرناً والبروتين. وهكذا، يمكن استخدام هذا الأسلوب التفريق بين خلايا CD4 + T السذاجة أن تيحجنرال موتورز الخلايا في المختبر، التي ستكون مفيدة في دراسة بيولوجيا الخلية GMحتي.
Introduction
خلايا CD4 + T مساعد (رح) مكونات أساسية للنظام المناعي، ولها دور حاسم في الدفاع المضيف ضد مسببات الأمراض الميكروبية وفي مراقبة السرطان والمناعة الذاتية1،،من23. عند تنشيط مستقبلات (تكر) خلية T، يمكن أن تكون متباينة السذاجة خلايا CD4 + “تي” في تيح1،حتي 2، تيح 17، أو تنظيم خلايا T (تريغ) تحت تأثير سيتوكين مختلف الأوساط2،4، 5. في الآونة الأخيرة، تم التعرف على مجموعة فرعية جديدة من خلايا تيح ، التي تنتج غالباً GM-CSF، واسمه جنرال موتورزحتي6. التفريق بين الخلايا المعدلة وراثياحتي تحركها إيل-7 من خلال تفعيل محول الإشارات ومنشط للنسخ 5 (STAT5). هذه الخلايا التعبير عن كمية كبيرة من GM-CSF حين وجود تعبير منخفضة من غيرها تيح-خلية السيتوكينات التوقيع مثل IFNγ وايل-176. تم العثور على GM-CSF تلعب دوراً حاسما في تطوير خلايا CD4 + T الخلية بوساطة نيوروينفلاميشن7،8. مقارنة مع IFNγ–أو إيل-17-الإعراب عن الخلايا أوتوريكتيفي T، معربا عن GM-CSF تي الخلايا المحولة إلى البرية من نوع الفئران (WT) تسبب ظهور أمراض سابقة وشدة المرض أعلى. وبالإضافة إلى ذلك، فشل خلايا تي Csf2–/–حمل النخاع الذاتية التجريبية (إي) بعد نقله أدوبتيفيلي إلى المستلمين WT، بينما خلايا تي التي تفتقر إلى IFNγ أو إيل-17A الإبقاء على القدرة على التوسط EAE7. وعلاوة على ذلك، تحسن حصار GM-CSF باستخدام الأجسام المضادة لتحييد خطورة المرض إي8. وعلاوة على ذلك، عن نقص في STAT5 في خلايا تي في الفئران في جيل تيحجنرال موتورز تقلص، ومن ثم، في مقاومة الفئران ع التنمية6. هذه النتائج تؤكد أهمية التعبير عن GM-CSF تيح الخلايا في أمراض المناعة الذاتية نيوروينفلاماتوري. وهكذا، سيكون إنشاء طريقة للتفريق بين الخلايا معربا عن GM-CSF تيح من السذاجة خلايا CD4 + T هامة في دراسة إمراضية neuroinflammation الذاتية والاستجابات المناعية T الخلية بوساطة. ومع ذلك، بروتوكول أن كفاءة يولد الخلايا المعدلة وراثياحتي من السذاجة مورين CD4 + لم يثبت.
نقدم هنا أسلوب الذي يميز موريني جنرال موتورزحتي الخلايا من خلايا CD4 + T ساذجة. هذا البروتوكول وصف الإجراء بأكمله، بما في ذلك استخراج الطحال من الماوس، وإعداد تعليق خلية واحدة والتحديد خلايا CD4 إيجابية، والأسفار تنشيط الخلية الفرز (نظام مراقبة الأصول الميدانية)، والخلية تيح التمايز والتحليل. خلايا T المتباينة على مساعد يتم تحليلها بواسطة سيتوكين داخل الخلايا تلطيخ جنبا إلى جنب مع التدفق الخلوي لتحديد التعبير سيتوكين على مستوى خلية واحدة، قبل بكر كمية في الوقت الحقيقي لتحديد التعبير سيتوكين المستوى مرناً، و بإليزا لتقييم التعبير سيتوكين في مستوى البروتين. يمكن تطبيق هذا الأسلوب للدراسات المتعلقة ببيولوجيا الخلايا تيحالمعدلة وراثيا تحت ظروف مختلفة، مثل ع، حيث الآلية العالمية-الخدمات القطرية دوراً هاما في نشوء المرض.
Protocol
Representative Results
Discussion
هنا يمكننا وصف بروتوكول في المختبر جنرال موتورزحتي التمايز من الماوس السذاجة CD4 + الخلايا، متبوعاً بتحليل الخلايا المتمايزة للتحقق من صحة الأسلوب. ملاحظة، يمكن استخدام الطحال والغدد الليمفاوية السذاجة CD4 + تي خلية تنقية والتمايز جنرال موتورزحتي. كانت المستحث التعبير سيتو…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
وأيد هذا الدراسة المنح المقدمة من “جامعة الصحة نظام سنغافورة الوطنية” (T1-2014-12 أكتوبر وسبتمبر T1-2015-10).
Materials
| RPMI 1640 | Biowest | L0500-500 | |
| FBS Heat Inactivated | Capricorn | FBS-HI-12A | |
| Penicillin-Streptomycin | Gibco | 15140122 | |
| 10x PBS | 1st Base | BUF-2040-10 | Diluted to 1x PBS in sterile water |
| EDTA | 1st Base | BUF-1053-100ml-pH8.0 | |
| 10X ACK buffer | Biolegend | 420301 | diluted in sterile water |
| cell strainer | SPL Life Sciences | 93070 | |
| CD4 microbeads | Miltenyi Biotec | 130-049-201 | |
| 2-Mercaptoethanol | Sigma | M7522 | |
| LS column | Miltenyi Biotec | 130-042-401 | |
| magnetic stand | Miltenyi Biotec | 130-042-303 | |
| 1ml syringe | Terumo | SS+01T | |
| Centrifuge | Eppendorf | Eppendorf 5810R | |
| Sony SY3200 cell sorter | Sony | Sony SY3200 cell sorter | |
| 50ml conical centrifuge tube | Greiner Bio-One | 210261 | |
| 15m conical centrifuge tube | Greiner Bio-One | 188271 | |
| FACS tube | Corning | 352054 | |
| 24 well cell culture plate | Greiner Bio-One | 662160 | |
| anti-mouse CD4 PerCP-eFluor 710 | eBioscience | 46-0041-82 | |
| PE conjugated anti-mouse CD25 (IL-2Ra, p55) | eBioscience | 12-0251-82 | |
| anti-human/mouse CD44 APC | eBioscience | 17-0441-82 | |
| anti-mouse CD62L FITC | eBioscience | 11-0621-85 | |
| Neubauer-improved counting chamber | Marienfeld | 640010 | |
| Hyclone Trypan Blue Solution | GE healthcare Life Sciences | SV30084.01 | |
| microscope | Nikon | Nikon Elipse TS100 | |
| Purified anti-mouse CD3e antibody | Biolegend | 100314 | |
| Purified hamster anti-mouse CD28 | BD Biosciences | 553295 | |
| Purified Rat anti-mouse IFNγ | eBioscience | 16-7312-85 | |
| Purified anti-mouse IL-4 Antibody | Biolegend | 504102 | |
| Recombinant Mouse IL-7 Protein | R&D system | 407-ML | |
| Recombinant Mouse IL-6 | R&D system | 406‑ML | |
| recombinant human TGF-beta | R&D system | 240-B-010 | |
| PMA | Merck Millipore | 19-144 | |
| Ionomycin | Sigma | I0634 | |
| GolgiPlug protein transport inhibitor | BD Biosciences | 51-2301KZ | |
| Intracellular Fixation&Permeabilization buffer set | eBioscience | 88-8824-00 | |
| anti-mouse GM-CSF PE | eBioscience | 12-7331-82 | |
| FITC anti-mouse IL-17A | Biolegend | 506908 | |
| APC anti-mouse IFN-gamma | Biolegend | 505810 | |
| GO Taq qPCR master mix | Promega | A6002 | |
| mouse GM-CSF ELISA Ready-SET-Go! | invitrogen | 88-7334-88 | |
| Mouse IL-17A Uncouted ELISA | invitrogen | 88-7371-22 |
References
- Zhu, J., Paul, W. E. CD4 T cells: fates, functions, and faults. Blood. 112, 1557-1569 (2008).
- Kara, E. E., et al. Tailored immune responses: novel effector helper T cell subsets in protective immunity. PLoS Pathogens. 10, e1003905 (2014).
- Bou Nasser Eddine, F., Ramia, E., Tosi, G., Forlani, G., Accolla, R. S. Tumor Immunology meets…Immunology: Modified cancer cells as professional APC for priming naive tumor-specific CD4+ T cells. Oncoimmunology. 6, e1356149 (2017).
- Dong, C. TH17 cells in development: an updated view of their molecular identity and genetic programming. Nature Reviews. Immunology. 8, 337-348 (2008).
- Korn, T., Bettelli, E., Oukka, M., Kuchroo, V. K. IL-17 and Th17 Cells. Annual Review of Immunology. 27, 485-517 (2009).
- Sheng, W., et al. STAT5 programs a distinct subset of GM-CSF-producing T helper cells that is essential for autoimmune neuroinflammation. Cell Research. 24, 1387-1402 (2014).
- Codarri, L., et al. RORgammat drives production of the cytokine GM-CSF in helper T cells, which is essential for the effector phase of autoimmune neuroinflammation. Nature Immunology. 12, 560-567 (2011).
- El-Behi, M., et al. The encephalitogenicity of T(H)17 cells is dependent on IL-1- and IL-23-induced production of the cytokine GM-CSF. Nature Immunology. 12, 568-575 (2011).
- Ivanov, I. I., et al. The orphan nuclear receptor RORgammat directs the differentiation program of proinflammatory IL-17+ T helper cells. Cell. 126, 1121-1133 (2006).
- Zhang, J., et al. A novel subset of helper T cells promotes immune responses by secreting GM-CSF. Cell Death and Differentiation. 20, 1731-1741 (2013).
- Croxford, A. L., Spath, S., Becher, B. GM-CSF in Neuroinflammation: Licensing Myeloid Cells for Tissue Damage. Trends in Immunology. 36, 651-662 (2015).
