Summary

In Vitro Differenziazione dei Mouse del Granulocyte-macrofago-colony-stimulating Factor (GM-CSF)-producendo le cellule T Helper (THGM)

Published: September 10, 2018
doi:

Summary

Qui, presentiamo un protocollo per differenziare murino granulocyte-macrophage-colony-stimulating-factor-producing linfociti T helper (THGM) da cellule T CD4 + ingenuo, incluso l’isolamento delle cellule T CD4 + Naive, differenziazione di THGM, e analisi delle cellule di THGM differenziate. Questo metodo può essere applicato agli studi del regolamento e la funzione delle cellule di THGM.

Abstract

Il fattore di stimolazione del granulocyte-macrofago-colonia (GM-CSF)-la produzione di cellule T helper (THGM) è un sottoinsieme di cellule helper T recentemente identificato che principalmente secerne GM-CSF senza produrre l’interferone (IFN) γ o interleuchina (IL) -17 e si trova a svolgono un ruolo essenziale nella neuroinfiammazione autoimmuni. Un metodo di isolamento di cellule T CD4 + ingenuo da una cella singola sospensione degli splenocytes e generazione di cellule THGM da cellule T CD4 + ingenuo sarebbe una tecnica utile nello studio dell’immunità mediata da cellule T e malattie autoimmuni. Qui descriviamo un metodo che differenzia le cellule di T di CD4 + ingenuo di topo in cellule di THGM promosse da IL-7. L’esito della differenziazione è stata valutata tramite l’analisi dell’espressione di citochine utilizzando diverse tecniche, tra cui intracellulare cytokine colorazione combinato con citometria a flusso, una reazione a catena quantitativa in tempo reale della polimerasi (PCR), e analisi enzima-collegata dell’immunosorbente (ELISA). Utilizzando il protocollo di differenziazione THGM come descritto qui, circa il 55% delle cellule espresso GM-CSF con una minima espressione di IL2 o IL-17. L’espressione predominante di GM-CSF dalle cellule di THGM è stato ulteriormente confermato dall’analisi dell’espressione di GM-CSF, IL2 e IL-17 a livelli di mRNA e di proteina. Pertanto, questo metodo può essere utilizzato per differenziare le cellule CD4 + T naive a THGM cellule in vitro, che saranno utili nello studio della biologia delle cellule di THGM.

Introduction

Linfociti CD4 + T helper (TH) sono componenti essenziali del sistema immunitario, avendo un ruolo cruciale nella difesa ospite contro gli agenti patogeni microbici, nella sorveglianza del cancro e nell’autoimmunità1,2,3. Al momento dell’attivazione del ricevitore (TCR) di cellule T, cellule T CD4 + ingenuo possono essere differenziate in TH1, TH2, TH 17, o regolamentazione T (Treg) cellule sotto l’influenza di citochine differenti ambienti2,4, 5. recentemente, un nuovo subset di cellule TH , che produce principalmente GM-CSF, è stato identificato e denominato THGM6. La differenziazione delle cellule di THGM è guidata da IL-7 attraverso l’attivazione di un trasduttore di segnale e attivatore di trascrizione 5 (STAT5). Queste cellule esprimono una grande quantità di GM-CSF pur avendo una bassa espressione di altri TH-cell firma citochine quali IFNγ e IL-176. GM-CSF è stato trovato per svolgere un ruolo critico nello sviluppo di CD4 + T cellulo-mediata neuroinflammation7,8. Rispetto al IFNγ o IL-17-esprimendo le cellule T autoreattive, GM-CSF-esprimendo T cellule trasferito al selvaggio-tipo topi (WT) ha causati un inizio più iniziale di malattia e la maggiore severità di malattia. Inoltre, le cellule di T di QCS2– / – non riuscito ad indurre encefalomielite autoimmune sperimentale (EAE) dopo essere stato trasferito passivamente ai destinatari WT, mentre le cellule di T che mancano IFNγ o IL-17A mantenuto la capacità di mediare EAE7. Inoltre, un blocco di GM-CSF utilizzando anticorpi neutralizzanti ha migliorato EAE malattia gravità8. Inoltre, una carenza di STAT5 in cellule di T in topi ha provocato in una generazione di THGM diminuita e, quindi, in una resistenza dei topi a EAE sviluppo6. Questi risultati sottolineano l’importanza delle cellule di T di GM-CSF-esprimendoH nella malattia autoimmune neuroinfiammatorie. Quindi, stabilire un metodo per differenziare le cellule di T di GM-CSF-esprimendoH da cellule T CD4 + ingenuo sarebbe importante nello studio della patogenesi autoimmune neuroinflammation e immunitaria mediata da cellule T. Tuttavia, un protocollo che efficientemente genera cellule THGM da murino ingenuo che CD4 + non è stata stabilita.

Qui presentiamo un metodo che differenzia cellule murine THGM da cellule T CD4 + ingenuo. Questo protocollo descrive l’intera procedura, compreso l’estrazione della milza dal mouse, la preparazione di una sospensione unicellulare, la selezione positiva CD4, la cella di fluorescenza-attivato ordinano (FACS) e la cellula di TH differenziazione e analisi. Il differenziato cellule T helper vengono analizzate da intracellulare cytokine colorazione combinato con citometria a flusso per determinare l’espressione di citochine a livello di singola cellula, mediante una PCR quantitativa in tempo reale per determinare l’espressione di citochine a livello di mRNA, e da ELISA per valutare l’espressione di citochine a livello di proteina. Questo metodo può essere applicato agli studi di biologia cellulare THGM in varie condizioni, come ad esempio EAE, dove GM-CSF svolge un ruolo importante nella patogenesi.

Protocol

Tutti i topi usati in questo protocollo sono stati il background genetico C57BL/6 e alloggiati in condizioni da organismi patogeni specifiche presso la National University of Singapore. Tutti gli esperimenti sono stati eseguiti utilizzando protocolli approvati dal comitato di uso della Università nazionale di Singapore e istituzionali Animal Care. 1. reagenti e preparazione del materiale Preparare 500 mL di tampone fosfato salino (PBS) contenente 2% siero bovino fetale (FBS) e 1 mil…

Representative Results

Cellule T CD4 + Naive isolate da due 8-settimana-vecchio maschio C57BL/6 topi sono stati divisi in tre porzioni. Una porzione delle cellule è stata differenziata in cellule di THGM seguendo il protocollo descritto. Un’altra porzione è stata coltivata in una condizione di THGM in presenza dell’anticorpo anti-IL-4 (10 µ g/mL) per testare l’influenza di un blocco di IL-4 nella differenziazione delle THGM. L’ultima parte è stata coltivata in una condizione…

Discussion

Qui abbiamo descritto un protocollo di una differenziazione in vitro THGM da ingenuo CD4 + cellule di topo, seguita da un’analisi delle cellule differenziate per convalidare il metodo. Della nota, linfonodi e milza può essere utilizzati per ingenuo purificazione di cellule T CD4 + e THGM differenziazione. L’espressione di citochine determinato macchiando intracellulari di cytokine combinato con citometria a flusso ha mostrato che circa il 55% delle cellule sono state indotte a diventare GM…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Questo studio è stato sostenuto da borse di studio dal National University salute sistema di Singapore (T1-2014 ott-12 e T1-2015 set-10).

Materials

RPMI 1640 Biowest L0500-500
FBS Heat Inactivated Capricorn FBS-HI-12A
Penicillin-Streptomycin Gibco 15140122
10x PBS 1st Base BUF-2040-10 Diluted to 1x PBS in sterile water
EDTA 1st Base BUF-1053-100ml-pH8.0
10X ACK buffer Biolegend 420301 diluted in sterile water
cell strainer SPL Life Sciences 93070
CD4 microbeads Miltenyi Biotec 130-049-201
2-Mercaptoethanol Sigma M7522
LS column Miltenyi Biotec 130-042-401
magnetic stand Miltenyi Biotec 130-042-303
1ml syringe Terumo SS+01T
Centrifuge Eppendorf Eppendorf 5810R
Sony SY3200 cell sorter Sony Sony SY3200 cell sorter
50ml conical centrifuge tube Greiner Bio-One 210261
15m conical centrifuge tube Greiner Bio-One 188271
FACS tube Corning 352054
24 well cell culture plate Greiner Bio-One 662160
anti-mouse CD4 PerCP-eFluor 710 eBioscience 46-0041-82
PE conjugated anti-mouse CD25 (IL-2Ra, p55) eBioscience 12-0251-82
anti-human/mouse CD44 APC eBioscience 17-0441-82
anti-mouse CD62L FITC eBioscience 11-0621-85
Neubauer-improved counting chamber Marienfeld 640010
Hyclone Trypan Blue Solution GE healthcare Life Sciences SV30084.01
microscope Nikon Nikon Elipse TS100
Purified anti-mouse CD3e antibody Biolegend 100314
Purified hamster anti-mouse CD28 BD Biosciences 553295
Purified Rat anti-mouse IFNγ   eBioscience 16-7312-85
Purified anti-mouse IL-4 Antibody Biolegend 504102
Recombinant Mouse IL-7 Protein R&D system 407-ML
Recombinant Mouse IL-6 R&D system 406‑ML
recombinant human TGF-beta R&D system 240-B-010
PMA Merck Millipore 19-144
Ionomycin Sigma I0634
GolgiPlug protein transport inhibitor BD Biosciences 51-2301KZ
Intracellular Fixation&Permeabilization buffer set eBioscience 88-8824-00
anti-mouse GM-CSF PE eBioscience 12-7331-82
FITC anti-mouse IL-17A Biolegend 506908
APC anti-mouse IFN-gamma Biolegend 505810
GO Taq qPCR master mix Promega A6002
mouse GM-CSF ELISA Ready-SET-Go! invitrogen 88-7334-88
Mouse IL-17A Uncouted ELISA invitrogen 88-7371-22

References

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Cite This Article
Lu, Y., Fu, X., Zhang, Y. In Vitro Differentiation of Mouse Granulocyte-macrophage-colony-stimulating Factor (GM-CSF)-producing T Helper (THGM) Cells. J. Vis. Exp. (139), e58087, doi:10.3791/58087 (2018).

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