In Vitro Differenziazione dei Mouse del Granulocyte-macrofago-colony-stimulating Factor (GM-CSF)-producendo le cellule T Helper (T_HGM)

Linfociti CD4 + T helper (T_H) sono componenti essenziali del sistema immunitario, avendo un ruolo cruciale nella difesa ospite contro gli agenti patogeni microbici, nella sorveglianza del cancro e nell’autoimmunità^1,2,3. Al momento dell’attivazione del ricevitore (TCR) di cellule T, cellule T CD4 + ingenuo possono essere differenziate in T_H1, T_H2, T_H 17, o regolamentazione T (Treg) cellule sotto l’influenza di citochine differenti ambienti^{2,4, 5}. recentemente, un nuovo subset di cellule T_H , che produce principalmente GM-CSF, è stato identificato e denominato T_HGM⁶. La differenziazione delle cellule di T_HGM è guidata da IL-7 attraverso l’attivazione di un trasduttore di segnale e attivatore di trascrizione 5 (STAT5). Queste cellule esprimono una grande quantità di GM-CSF pur avendo una bassa espressione di altri T_H-cell firma citochine quali IFNγ e IL-17⁶. GM-CSF è stato trovato per svolgere un ruolo critico nello sviluppo di CD4 + T cellulo-mediata neuroinflammation^7,8. Rispetto al IFNγ o IL-17-esprimendo le cellule T autoreattive, GM-CSF-esprimendo T cellule trasferito al selvaggio-tipo topi (WT) ha causati un inizio più iniziale di malattia e la maggiore severità di malattia. Inoltre, le cellule di T di QCS2– / – non riuscito ad indurre encefalomielite autoimmune sperimentale (EAE) dopo essere stato trasferito passivamente ai destinatari WT, mentre le cellule di T che mancano IFNγ o IL-17A mantenuto la capacità di mediare EAE⁷. Inoltre, un blocco di GM-CSF utilizzando anticorpi neutralizzanti ha migliorato EAE malattia gravità⁸. Inoltre, una carenza di STAT5 in cellule di T in topi ha provocato in una generazione di T_HGM diminuita e, quindi, in una resistenza dei topi a EAE sviluppo⁶. Questi risultati sottolineano l’importanza delle cellule di T di GM-CSF-esprimendo_H nella malattia autoimmune neuroinfiammatorie. Quindi, stabilire un metodo per differenziare le cellule di T di GM-CSF-esprimendo_H da cellule T CD4 + ingenuo sarebbe importante nello studio della patogenesi autoimmune neuroinflammation e immunitaria mediata da cellule T. Tuttavia, un protocollo che efficientemente genera cellule T_HGM da murino ingenuo che CD4 + non è stata stabilita.

Qui presentiamo un metodo che differenzia cellule murine T_HGM da cellule T CD4 + ingenuo. Questo protocollo descrive l’intera procedura, compreso l’estrazione della milza dal mouse, la preparazione di una sospensione unicellulare, la selezione positiva CD4, la cella di fluorescenza-attivato ordinano (FACS) e la cellula di T_H differenziazione e analisi. Il differenziato cellule T helper vengono analizzate da intracellulare cytokine colorazione combinato con citometria a flusso per determinare l’espressione di citochine a livello di singola cellula, mediante una PCR quantitativa in tempo reale per determinare l’espressione di citochine a livello di mRNA, e da ELISA per valutare l’espressione di citochine a livello di proteina. Questo metodo può essere applicato agli studi di biologia cellulare T_HGM in varie condizioni, come ad esempio EAE, dove GM-CSF svolge un ruolo importante nella patogenesi.