Hier präsentieren wir Ihnen ein Protokoll zur autologen Muskel-Stammzellen in der Nähe zu den wiederkehrenden laryngeal Nerv mit Hilfe eines elektrischen Nervenstimulator zu injizieren. Diese neuartige Technik kann nützlich für die Behandlung von equine rezidivierende Kehlkopf Neuropathie werden.
Häufig wiederkehrende Kehlkopf Neuropathie (RLN) betrifft Pferde und zeichnet sich durch abnorme Atemwege Sounds und Übung Intoleranz. Der wiederkehrende laryngeal Nerv zeigt Läsionen der Demyelinisierung. Der Vorteil der Anwendung von Stammzellen demyelinated Nerven wurde in verschiedenen Tiermodellen nachgewiesen. Das Ziel der Studie war es, die Machbarkeit und Sicherheit eine Peri-neuronale Injektion von autologem Muskel abgeleitet mesenchymalen Stammzellen auf den linken wiederkehrende laryngeal Nerv bei gesunden Pferden zu testen, mithilfe eines elektrischen Nervenstimulator.
Muskel-abgeleitete Stämme Zelle stammen aus fünf gesunde Traber Pferde durch Stichproben 20 mg von Muskelgewebe mit einer halbautomatischen 14 G-Biopsie-Nadel aus dem Trizeps-Muskel. Bewegungen des Kehlkopfes sind überwachte über oberen Atemwege Videoendoskopie. Der linken wiederkehrende laryngeal Nerv wird mit einer Nadel isolierte Nervenblockade angeflogen. Nervenstimulation gilt, ab 2 mA und die erfolgreiche Entführung von der linken Arytenoid wird überwacht. Die Reizintensität wird schrittweise reduziert. Wenn ein Verlust der motorischen Reaktion beobachtet wird, bei 0,5 mA, 107 autologe Muskel-derived Stem Zellen injiziert. Zwei Prüfern, die zu dem Zeitpunkt geblendet sind, erzielen die laryngeal Funktion der Pferde vor der Behandlung und am Tag 1, Tag 7 und 28. Tag nach der Injektion der Zellen. In einem sechsten Pferd wird 1 mL 2 % Lidocain zur weiteren Bestätigung der korrekten Positionierung der Nadel injiziert. Dies führt zu eine vorübergehende Lähmung des linken Arytenoid Knorpel.
Diese Studie beweist, dass die wiederkehrende laryngeal Nerv mit Hilfe einer elektrischen Nervenstimulator angefahren werden kann und, dass die elektrische Stimulation des Nervus gut von den Pferden toleriert. Keine Änderung der laryngeal Funktion wurde in keinem der Pferde nach der Injektion von Stammzellen beobachtet. Weitere Studien sollten durchgeführt werden, um die Auswirkungen der eine Peri-neuronale Injektion von autologem Muskel abgeleitet mesenchymalen Stammzellen zu Pferde leiden RLN zu beschreiben.
RLN ist eine allgemeine Pathologie der oberen Atemwege bei Pferden, die durch unterschiedliche Grade der Arytenoid Lähmung gekennzeichnet. Die linke Seite des Kehlkopfes ist am häufigsten betroffen. Die Prävalenz der Erkrankung kann bis zu 35 % in bestimmten Populationen Pferd erreichen. Obwohl mehrere Hypothesen versuchten, die Ätiologie und Pathogenese dieser Krankheit erklären, bleibt die genaue Ursache der RLN ungewiss. Die Pathologie wird beschrieben als eine distale Axonopathy des Nervs wiederkehrende Kehlkopf mit Läsionen der Demyelinisierung aber auch ein gewisses Maß an remyelinisierung. Diese Axonopathy führt zu der Denervation des inneren Kehlkopf Muskeln und damit einhergehende Atrophie1,2. Diese Pathologie ist oft langsam progredient und führt zum Totalverlust der Arytenoid Entführung der betroffenen Seite3.
Betroffene Pferde emittieren abnorme Lungenauskultation während des Trainings und manchmal zeigen Übungsintoleranz in schwereren Fällen. Die definitive Diagnose erfolgt durch die endoskopische Untersuchung auf einem Pferd nicht sediert stehen, wo ein teilweiser oder vollständiger Verlust der Kehlkopf Entführung1,2,4beobachtet wird. Derzeit ist die häufigste Therapie Laryngoplasty (auch bekannt als “Tie-Back”), die manchmal eine Ventriculo-Cordectomy zugeordnet ist. Obwohl die Erfolgsquote dieser Operationen als gut bis ausgezeichnet5gilt, sind postoperative Komplikationen sehr häufig. Die häufigste Komplikation ist einen allmählichen Verlust der Entführung. Barnett Et al. 6 wies einen Verlust von mindestens einer Sorte Kindesentführungen innerhalb der ersten sechs Wochen nach der Operation bei mindestens 76 % der Pferde. Andere Komplikationen wie Prothese Versagen, Husten und Atemwege Kontamination sind auch gemeldeten5.
Mesenchymaler Stammzellen (MSCs) sind ein Teil der pferdemedizin in Forschung und Praxis seit mehr als einem Jahrzehnt gewesen, obwohl bewiesen ist, dass Studien über die Effizienz noch knapp sind. Die beiden am häufigsten genutzten Quellen von adulten mesenchymalen Stammzellen bei Pferden sind Knochenmark und Fettgewebe7. Beide Sampling-Techniken sind relativ invasiv und nicht immer auf eine ausreichende Anzahl von Zellen führen. Vor kurzem Ceusters Et al. 7 beschrieben die Kultur der Stammzellen aus quergestreiften Muskelgewebe, welches durch eine weniger invasive Technik Microbiopsy anfällt.
MSCs sind in der Lage, selbst-Erneuerung, Eigenstromerzeugung und Multipotenz Differenzierung7,8. Ihre Fähigkeit, in allen Mesoderm Linien von Fett, Knochen, Muskeln und Knorpel zu differenzieren ist jetzt gut etablierte9. Jedoch unter bestimmten Umweltbedingungen, können sie in nicht-Mesenchymale Linien wie Neuronen und Astrozyten Myelinating Zellen des peripheren Nervensystem und das Rückenmark9,10zu differenzieren. MSCs haben bereits in mehreren Neuropathie Modelle10,11verwendet. Ihre Fähigkeit, in Bereiche des degenerierten Nervengewebe zu migrieren und neuronalen Zellen regenerieren wurde nach einer systemischen und lokalen Verwaltungen11nachgewiesen. Darüber hinaus können Schwann-wie Zellen aus MSCs rekrutieren Makrophagen zu entfernen zelltrümmer und sezernieren neurotrophen Faktoren axonale Wachstum und remyelinisierung9zu fördern.
Das Ziel dieser Studie ist, die Technik der ein Nerv Stimulator-geführte Injektion von Muskel-autologe Stammzellen in der Nähe der linken wiederkehrende laryngeal Nerv bei gesunden Pferden zu beschreiben. In der Regel wird ein Nervenstimulator verbunden mit einer Injektionsnadel für die Elektro-Lokalisierung von peripheren Nerven eingesetzt, um Lokalanästhetika auf diesem Gebiet12anwenden. Ein schwacher Gleichstrom Impuls ist in der Nähe des Nervs induzieren eine motorische Reaktion geliefert. Die Fähigkeit, diese motorische Reaktion produzieren hängt von mehreren Parametern, wie der leitende Bereich der Nadel, jede Impedanz des Gewebes, die aktuelle angewendet, die Impulsdauer und die Entfernung der Nadel des Nervs. Nerv Stimulator Nadeln sollen haben eine sehr restriktive leitfähige Fläche an der Spitze der Nadel, während der Rest der Nadel isoliert ist. Dieses Design hilft, um genau den Nerv zu lokalisieren. Moderne Nerv Stimulatoren passen sich unterschiedlichen Gewebe Impedanzen und liefern die konstante Stromstärke an der Maschine eingestellt. Darüber hinaus verwenden die meisten Maschinen eine Impulsdauer von 0,1 s, so dass die bestimmende Parameter der aktuellen angewendet und der Abstand zur Nadel sind. Die Beziehung zwischen der Nadel-Nerv-Abstand und die aktuellen notwendig, um eine motorische Reaktion produzieren wird durch Coulomb’schen Gesetz beschrieben: E = kQ/R; wo E ist die erforderliche Stimulation Ladung, k ist die Coulomb-Konstante Q ist die minimal erforderliche Stimulation Ladung und r ist der Abstand zwischen den beiden Elektroden. In der Elektro-Lokalisierung der Nerven der Abstand zwischen den beiden Elektroden gilt die Nadel-Nerv Entfernung12. Elektrischer Ladung verflüchtigt sich nach der Regel des Platzes inverse der Nadel-Nerv Abstand13. Klinischen Praxis hat gezeigt, dass der Motor nerve Stimulation bei 0,5, die mA stark an die erfolgreiche Nervenblockade korreliert und ein Verlust der motorischen Signal bei geringeren strömen den Benutzer verhindert versehentliche intraneuronal Injektionen Verwaltung. Das Ziel dieser Studie ist es, die Machbarkeit und Sicherheit dieser Technik in einer begrenzten Anzahl von Pferden zu testen. Wenn die Machbarkeit und Sicherheit dieser Technik bestätigt werden, kann es leicht zu betroffenen Pferden übertragen werden. Weitere, equine RLN dient als ein Modell für degenerative Neuropathie.
Dieses Protokoll beschreibt die erfolgreiche Anwendung von Muskel-autologe Stammzellen, die wiederkehrende Kehlkopfnerven bei Pferden mit einem Nerv Stimulator-geführte Ansatz. Die Ernte der Muskel Microbiopsy Probe, sowie die Isolierung, die Kultur und die Charakterisierung der Stammzellen, haben vor, detailliert beschrieben worden, während die Injektion dieser Zellen in der Nähe einen peripheren Nerv ist ein original. Die Electro-Lokalisierung des Nervs mit einem elektrischen Nervenstimulator diente für die vorliegende Studie und diente der mesenchymalen Stammzellen in unmittelbarer Nähe zu den wiederkehrenden laryngeal Nerv zu injizieren. Die Reaktion wurde durch video-Endoskopie durch Nasopharynx überwacht. Wenn bei der Positionierung der Nadel, andere Nerven angeregt wurden, war die entsprechende Bewegung auf die Endoskopie-Bildschirm sichtbar. Eine erfolgreiche Stimulation des Nervus wiederkehrende Kehlkopf war geprägt von der typischen Entführung von Arytenoid Knorpel. In ein Pferd war Lokalanästhetikum eingespritzt, um eine vorübergehende Lähmung des Arytenoid Muskels zu induzieren. Obwohl die erfolgreiche Implantation der Zellen in der Nähe des Nervs nicht speziell in der vorliegenden Studie getestet wurde, erwies sich die Elektro-Lokalisierung von den Nerv und die Injektion mit einem geringen Strom, dass die Stammzellen in der Nähe der Nerven angewendet wurden. Die Nähe der Injectate des Nervs, zeigte weiter eine erfolgreiche Motorblock induziert durch eine Injektion eines lokalen Betäubungsmittels.
In den verbleibenden fünf Pferden waren die Zeit von der ersten Anregung bis die erfolgreiche Stammzell-Injektion von 3 bis 12 min. variiert Pferde leicht während des Eingriffs sediert, deren Einhaltung die elektrische Stimulation erhöht. Keines der Pferde zeigte Nebenwirkungen zu jeder Zeit kann darauf hinweist, dass die Dauer der Stimulation bei Bedarf zu guten Nadelpositionierung verlängert werden. Eine steile Lernkurve soll beobachtet werden, wenn der Bediener diese Technik regelmäßig und in einer größeren Zahl von Pferden mit unterschiedlichen Anatomie verwendet.
Pferde häufig leiden RLN, die sich durch unterschiedliche Grade der Lähmung des linken Arytenoid Knorpel führt zu abnormalen Lungenauskultation auszeichnet und Übung Intoleranz. Eine Histologie der betroffenen Nerven zeigt typische Läsionen des peripheren Neuropathie16. Peripherer Neuropathie ist eine Bezeichnung für verschiedene Arten von peripheren Nervenläsionen beeinträchtigte Empfindungen, Bewegungen oder Organfunktionen führt. Die Ursachen sind sehr variabel und können Diabetes, Nährstoffmangel, eine Behandlung mit bestimmten Medikamenten, einer traumatischen Verletzung, Ischämie oder einer Infektion, oder sie können idiopathische sein. Unabhängig von der Ursache, periphere Neuropathien teilen gemeinsame histopathologische Anzeichen, wie Wallersche Degeneration, distale Axonopathy oder segmentale Demyelinisierung. Es hat sich gezeigt, dass die Verwaltung von mesenchymalen Stammzellen Geschädigten peripheren Nerven von Vorteil für ihre Regeneration; die zugrunde liegenden Mechanismen sind jedoch nicht gut verstanden. Traditionell, glauben wir, dass die Stammväter von Fettgewebe, Muskeln, Knorpel und Knochengewebe wird nur mesenchymaler Stammzellen differenzieren, aber unter bestimmten Bedingungen haben sie gezeigt, dass in Myozyten17, Astrozyten18 zu differenzieren , und Myelinating Zellen der peripheren19 und zentralen Nervensystems19. Während einer in-vitro- Kultur wird eine Exposition gegenüber Neuropeptide die Differenzierung von mesenchymalen Stammzellen in Zellen, die mit dem Ausdruck neuronalen Marker21,22begünstigen. Mehrere in Vivo Studien belegen die positive Wirkung von mesenchymalen Stammzellen auf Nervenregeneration und eine funktionelle Erholung in Ratte-Modellen der Ischias-Nerv Verletzung10,23. Dies wird wahrscheinlich durch günstige Umgebungsbedingungen verursacht, die die Differenzierung von Stammzellen in gewebespezifische Zellen24beitragen. Zukünftige Studien sollten auch diese Technik für die Verwaltung der bereits differenzierten Zellen in RLN betroffenen Pferde untersuchen.
Nach bestem Wissen und gewissen ist dies der erste Bericht, der beschreibt die Verwendung von ein Nervenstimulator, einen peripheren Nerv zu lokalisieren, um eine gezielte Behandlung hinein zu injizieren. Andere periphere Nerven Krankheiten in verschiedenen Arten, wie neuropathische Schmerzen können durch die Gabe von Stammzellen in der Nähe der Nerven25,26behandelt werden. Zukünftige Studien sollten testen, welche Auswirkungen dieser Technik in klinischen Patienten und das Risiko der Migration und das Potenzial der Differenzierung der injizierten Zellen zu untersuchen.
The authors have nothing to disclose.
Die Studie wurde vom Mont-le-Soie Equine Research Centre finanziert.
Detomidine (Domidine) | Dechra | sold through pharmacy | |
Lidocaine (Xylocaine) | Movianto | sold through pharmacy | |
TOF Watch S (Nerve stimulator) | Alsevia | 79950161 | |
TSK Starcut (Biopsy needle) | STSK laboratory | SAG – 14090C | |
Electrostimulation needle | Pajunk | 001185-79 | |
DMEM – F12 (culture medium) | Lonza | LO BE12-719F | |
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Amphotericin B (Fungizone) | Lonza | 17-836E | |
Phospate buffered saline | Lonza | LO BE17-512F | |
24-multiwell dish | Corning | 3524 | |
Trypsin | Life technologies | 12604 | |
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Percoll PLUS | GE Healthcare | 17544502 | |
NaCl | Sigma | S8776 | |
T-25cm² flasks | Nunclon | 136196 | |
T-175 cm² flasks | Nunclon | 178883 | |
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