Nervio estimulador guiado por la inyección de células madre autólogas cerca de nervio laríngeo recurrente izquierdo equino

La Comisión para el uso ético de los animales de la Universidad de Lieja aprobó el protocolo de estudio. 1. músculo Microbiopsy Identificar el sitio de ejemplo por inspección visual y palpación de la cabeza larga del músculo tríceps, aproximadamente de la línea media entre el punto del codo y del hombro. Clip de una zona de aproximadamente 2 x 2 cm2 con una maquinilla eléctrica. Aplicar lavado quirúrgico de poliyoduro jabón líquido y comprime el alcohol durante 1 minuto sobre el área recortado. Inyectar por vía subcutánea 1 mL de solución de lidocaína 2% con una aguja de 25 G en el centro de la zona recortada y desinfectada. Frote las manos con jabón antibacterial para manos. Colóquese guantes estériles. Utilice un paño estéril desechable como una superficie estéril para colocar la aguja de la biopsia y el trocar en. Brazo de la aguja para biopsia 14 G semiautomática tirando el mecanismo de resorte como se muestra en las Figuras 1b y 1C. Lanzamiento de la aguja de biopsia para familiarizarse con su mecanismo. Coloque la aguja para biopsia armado sobre la superficie estéril. Familiarizarse con el trocar, que consiste en una cánula y un obturador como se muestra en la figura 1un. Figura 1 : El conjunto de aguja de biopsia. El conjunto de aguja de biopsia consiste en (una) la cánula y su obturador y la biopsia de aguja (de arriba a abajo). Los otros paneles muestran la aguja de biopsia en su (b) neutro y (c) posición de armado. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura. Preparar el trocar la cánula y el obturador y mantenerlos en una posición bloqueada. Introducir el trocar perpendicular a la piel a través de la zona anteriormente desensitized. Haga avanzar el trocar a la posición donde la punta del trocar se aproximadamente 1,5 cm de profundidad en el músculo. Sacar el trocar, disociar la cánula de su obturador y coloque el obturador sobre la superficie estéril. Introducir la aguja para biopsia armados a través de la cánula. Introducir la aguja y la cánula a través de la incisión de la piel en el músculo. Avanzar la aguja a una posición donde la punta de la aguja está en el centro de la cabeza larga del músculo tríceps. Suelte la aguja para biopsia y luego saque la aguja de biopsia, junto con la cánula. Tire de la aguja para biopsia de la cánula. Dejar la cánula en la superficie estéril. Abrir la aguja de biopsia tirando de la primavera con una mano y sosteniendo con la otra.Nota: La muestra se hace visible en la punta de la aguja de biopsia. Con la ayuda de una segunda persona, abra el tubo de muestra que contiene el medio de la muestra. Utilice una aguja de hipodérmica 19 G para quitar la pieza de músculo pequeño de la aguja para biopsia. Coloque la muestra de músculo en el medio de muestreo. Cierre el tubo con el tapón de rosca y suavemente incline x 2 para asegurar que la muestra esté flotando en el medio. Brazo de la aguja de biopsia. Tome la cánula de la estéril superficie y volver a montar la aguja de la biopsia armados y la cánula. Introducir la aguja armada y la cánula a través de la incisión en la piel como se describió anteriormente. Repita el procedimiento de la muestra x 2 – 3 hasta que se muestrean aproximadamente 20 mg de tejido muscular. Cierre el tubo de muestreo. Gire suavemente el tubo de 2 x para mezclar las piezas de músculo con el medio de muestreo. Enviar las muestras al laboratorio a una temperatura constante entre 4 a 8 ° C.Nota: El laboratorio luego procesará la muestra. El protocolo puede hacer una pausa aquí. El procedimiento es bien tolerado y no se observa dolor en la parte de muestreo. En el caso de dolor muscular en el sitio de muestreo, administrar un tratamiento analgésico adecuado. 2. tratamiento de las células Nota: Las células madre utilizadas en este estudio han sido preparadas según el método descrito por Ceusters et al. 7. su artículo también describe la caracterización de las células. Empezar por preparar el medio de cultivo específico, DF20, mediante la adición de 20% de inactivadas por calor suero fetal bovino, 5 mL de penicilina (1.000 UI/mL)-estreptomicina (10.000 μg/mL) y 2,5 mL de anfotericina B (250 μg/mL) a una botella de 500 mL de un disponible en el mercado medio de cultivo con glutamina y rojo de fenol. Vierta 150 μL de medio de cultivo DF20 en cada uno de los 16 pozos interiores de un plato 24-multi-well. Vierta 1 mL de tampón fosfato salino (PBS) [cloruro de potasio (200 mg/L), potasio Fosfato monofásica (200 mg/L), cloruro de sodio (8.000 mg/L) y fosfato de potasio difásico (2.160 mg/L)] en los pocillos exteriores restantes. Enjuague el músculo pequeño piezas x 2 en PBS. Separar en trozos muy pequeños con la ayuda de un bisturí y pinzas y coloque un pedazo pequeño (del tamaño de la punta de la hoja de bisturí) en cada interno 16 bien del plato varios pocillos. Coloque el plato varios pocillos en una incubadora que mantenga en las condiciones siguientes: 37 ° C, 21% O2y 5% CO2. Vigilar los pozos de todos los días bajo un microscopio invertido y añadir 50 μl de DF20 si es necesario para evitar que las células de la desecación.Nota: Después de aproximadamente 10 d, habrá suficientes células de explante para permitir el aislamiento de células madre. El protocolo puede hacer una pausa aquí. Cuando un halo de células es visible en el músculo de explantes, deseche el explante del tejido muscular. Separar las células mediante el uso de 150 μL de una solución de tripsina EDTA que contiene en cada pocillo: desechar el medio de cultivo, lavar las células con 1 mL de PBS, descartar el PBS y añadir la solución de tripsina para un máximo de 10 min a 37 ° C. Agregar medio de cultivo para detener la acción de la tripsina, la suspensión de células de la cosecha y, luego, centrifugar la suspensión de células a 200 x g durante 10 min a 37 ° C. Deseche el sobrenadante y suspender el sedimento en una solución de sal equilibrada. Transferir la suspensión de células en un gradiente de densidad discontinuo de 3 capas (15%, 25% y 35%). Centrifugar el tubo que contiene la suspensión de células y la solución de gradiente de densidad discontinuo a 1.250 x g por 20 min a 25 ° C. No use el freno de la centrifugadora. Tenga en cuenta las fracciones de células con diferentes densidades que aparecerán entre las diferentes capas de la solución del gradiente de densidad discontinuo después de la centrifugación. Continuar la cultura con la fracción entre el 15 y el 25%. Transferir a un tubo y lávelo con una solución salina equilibrada. Centrifugue la suspensión de células a 200 x g durante 10 min a 37 ° C. Deseche el sobrenadante. Proceder a suspender el sedimento en 1 mL de DF20. Rellenar previamente un frasco de cultivo celular, con una superficie de 25 cm2, con 6 mL de DF20. Las células de transferencia en el matraz de cultivo de células prellenadas y cultura en una incubadora con las condiciones siguientes: 37° C, 21% O2y 5% CO2.Nota: El protocolo se puede detener aquí. Supervisar las células todos los días bajo un microscopio invertido. Cambiar el medio de cultivo si es necesario (Deseche el medio viejo y añadir 6 mL de medio de cultivo nuevo). Determinar la confluencia celular mediante la observación de las capas en los platos de la cultura, utilizando un microscopio óptico a una ampliación predefinida. Estimar la superficie del plato que está ocupado por las células. Trabajo en un aumento microscópico fijo para cada observación para poder evaluar la confluencia. Cuando las células ocupan el 85% de la superficie del plato, proceda con el paso de las células. Cuando las células son confluentes, separar con una solución de tripsina que contiene el EDTA con el mismo protocolo como se describe en el paso 2.4. Luego, centrifugar la suspensión de células a 200 x g durante 10 min a 37 ° C. Deseche el sobrenadante y proceder con la resuspensión de las células en 5 mL de DF20. Colocarlos en un frasco de cultivo celular de 175 cm2 Prellenado con 25 mL de DF20. Colocar el matraz en una incubadora con las condiciones siguientes: 37° C, 21% O2y 5% CO2.Nota: El protocolo se puede detener aquí. Supervisar las células todos los días bajo un microscopio invertido. Cambiar el medio si es necesario (Deseche el medio viejo y añadir 30 mL de medio nuevo). Cuando las células son confluentes, separe con tripsina-EDTA como se describe en el paso 2.4. Luego, centrifugar la suspensión de células a 200 x g durante 10 min a 37 ° C. Deseche el sobrenadante y suspender las células en 6 mL de DF20. Colocar 1 mL de la suspensión celular en seis frascos de 175 cm2 , cada uno Prellenado con 25 mL de DF20 y cultivo a 37 ° C en un incubador de CO2 (con 21% de O2 y 5% CO2). Supervisar las células todos los días bajo un microscopio invertido. Cambiar el medio si es necesario (Deseche el medio viejo y añadir 30 mL de medio nuevo en cada frasco). Cuando las células son confluentes, separe con tripsina-EDTA como se describe en el paso 2.5. Centrifugarlos 3 x a 200 x g durante 10 min a 37 ° C y descarte el sobrenadante en cada paso. Contar las células con la ayuda de un Bürker contando a cámara y un microscopio de luz. Preparar una suspensión celular de 10 millones de células/mL de un medio específico de la criopreservación. Congelación de dosis terapéuticas de 1 x 107 células en 1 mL de medio de congelación y guárdelos en la fase de vapor de nitrógeno líquido hasta su uso.Nota: El protocolo se puede detener aquí. Las células en la cubeta de hielo seco para uso final de la nave. 3. inyección de las células Nota: Se requieren dos personas para realizar la inyección de las células madre. Calentar la suspensión de células progresivamente a la temperatura ambiente. Aspirar la suspensión en una jeringa de 2 mL. SEDAR el caballo inyectando detomidina 10 μg/kg en la vena yugular con aguja hipodérmica 19 G. Espere 5 minutos ver el efecto completo de la sedación, que se hace visible por la característica posición de cabeza del caballo. Clip de una zona de 20 x 10 cm2 en la región laríngea izquierda del caballo con un clipper, como se muestra en la figura 2. Luego, aplicar un lavado quirúrgico de poliyoduro jabón y alcohol para la región recortada. Colocar un endoscopio flexible de vídeo estándar a través de la fosa nasal izquierda del caballo y avanzar hacia la nasofaringe. Ajuste la posición del endoscopio hasta que se obtiene una vista completa de cartílagos aritenoideo y la epiglotis. Mantener el endoscopio en esta posición durante el procedimiento y gire a la pantalla de video endoscopio hacia los operadores. Conecte la aguja de estimulación, inyección al electrodo negativo del estimulador del nervio. Mantener las condiciones estériles de la aguja. Conectar el electrodo positivo del estimulador del nervio con un remiendo del electrodo, que se pega a la zona de piel recortada. Conectar la jeringa que contiene la suspensión de células de la línea de inyección y rellenar previamente el tubo para el aire del sistema de la persecución. Recuerde que el volumen del sistema y preparar una jeringa con el mismo volumen de solución salina estéril. Si no estás familiarizado con esta técnica, utilizar un transductor de ultrasonido lineal de 5 a 7 MHz desinfectadas para visualizar las estructuras anatómicas en la región de interés. Utilizar un ultrasonido estéril gel de acoplamiento para aumentar la calidad de imagen. Visualizar la laringe y los vasos que se ejecutan en la región dorsal de la laringe. Una vez familiarizado con la anatomía de la región, introducir la aguja de estimulación, inyección hacia el aspecto dorsolateral de la laringe. Cuando se aproxime el aspecto dorsolateral de la laringe, iniciar el estimulador del nervio en el modo de estimulación de 1 Hz con una corriente de 2 mA. Suavemente mueva la aguja hacia la posición del nervio laríngeo recurrente observando la vista endoscópica en la pantalla. Tan pronto como el movimiento de abducción del cartílago aritenoideo izquierdo es visible en la pantalla de vídeo, reduzca la corriente hasta que desaparezca el movimiento manteniendo la aguja en el lugar. Identificar la posición ideal de la aguja. Considerar una pérdida de respuesta motor en 0.5 mA como la distancia ideal del nervio. Cuando persisten movimientos del cartílago aritenoideo con corrientes inferiores a 0,4 mA, no inyectar las células, ya que puede causar una inyección intraneuronal. Cuando la pérdida de respuesta de motor en 0.5 mA se observa, inyectar la suspensión celular con células madre autólogas de 107 y descargue la línea de inyección con la solución salina preparada en el paso 3.6. Esto inyectará el resto de la suspensión que quedaba en el tubo de inyección. Después de la inyección de las células, sacar la aguja y el endoscopio. Deje que el caballo a recuperarse de la sedación. Ningún tratamiento adicional es necesario para el sitio de la biopsia.