Нерва стимулятор руководствуясь инъекций аутологических стволовых клеток у лошадей оставили ПГН

Комиссия для этического использования животных из Университета Льеж одобрил протокол исследования. 1. мышц Microbiopsy Идентифицировать образец сайта визуальный осмотр и пальпация, в длинная голова трехглавых мышц, примерно срединной линии между точкой локтя и плеча. Клип зоны приблизительно2 2 x 2 см с электрической машинки. Применять хирургические скраб, состоящий из полииодидов жидкого мыла и алкоголя сжимает за 1 мин через обрезанную область. Ввести подкожно 1 мл 2% раствора лидокаина с 25 G иглы в центре подстриженные и обрабатываемой зоны. Вымыть руки с мылом антибактериальных руку. Наденьте стерильные перчатки. Используйте одноразовые стерильные Пелерина как стерильные поверхность для размещения биопсия иглы и троакара на. Рукоятка полуавтоматические 14 G биопсия иглы, потянув пружинный механизм, как показано в цифры 1b и 1 c. Релиз биопсия иглы для ознакомления с его механизмом. Место вооруженных биопсия иглы на поверхности стерильные. Ознакомиться с троакара, который состоит из канюли и затвора, как показано на рисунке 1. Рисунок 1 : Биопсия иглы набор. Биопсия иглы состоит из () канюлю и его затвора и биопсия иглы (сверху вниз). Другие панели показывают нейтральных биопсия иглы в его (b) и (c) вооруженных позиции. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры. Подготовьте троакара, сборка канюлю и затвора и держать их в закрытом положении. Ввести троакара перпендикулярно на кожу через ранее десенсибилизированные зону. Заранее троакар в позицию, где кончик троакара находится около 1,5 см глубоко в мышцу. Вынуть троакара, отделить канюли из его затвора и место затвора на поверхности стерильные. Ввести вооруженные биопсия иглы через канюлю. Ввести иглу и катетер через разрез в мышцу. Заранее иглу в позицию, где кончик иглы находится в середине длинная голова трехглавых мышц. Отпустите биопсия иглы, а затем вытащить биопсия иглы вместе с канюли. Вытяните биопсия иглы из канюли. Оставьте канюлю на поверхности стерильные. Откройте биопсия иглы, потянув весной с одной стороны и удерживая его с другой.Примечание: Образец становится видимым на кончике иглы биопсии. С помощью второго лица Откройте образец трубки, содержащий среднего образца. Используйте 19 G подкожных игл для удаления крошечные мышцы кусок от биопсия иглы. Поместите образец мышц в среде выборки. Закройте трубку с винтовой крышкой и аккуратно наклоните его 2 x, чтобы обеспечить, что образец располагается в среде. Рукоятка биопсия иглы. Возьмите канюля с поверхности стерильных и соберите вооруженных биопсия иглы и канюли. Внедрить вооруженные иглы и катетер через разрез кожи как описано ранее. Повторите процедуру образца 2 – 3 x до тех пор, пока около 20 мг мышечной ткани пробы. Закройте трубку выборки. Осторожно поверните трубку 2 x смешивать части мышцы с среднего выборки. Корабль образцов в лабораторию при постоянной температуре 4-8 ° C.Примечание: Лаборатория будет затем обрабатывать образца. Протокол может быть приостановлена здесь. Процедура переносится хорошо и не наблюдается болезненность в стороне выборки. В маловероятном случае болезненность мышц наблюдается на участке отбора проб управлять соответствующим болеутоляющее лечение. 2. Лечение клеток Примечание: Стволовые клетки, используемые в данном исследовании были подготовлены в соответствии с методом, описанным в Ceusters et al. 7. их статье также описываются характеристики клеток. Начните с подготовки конкретных питательной среды, DF20, добавив 20% тепла инактивированная плода бычьим сывороточным, 5 мл пенициллина (1000 МЕ/мл)-стрептомицином (10 000 мкг/мл) и 2,5 мл амфотерицин B (250 мкг/мл) бутылка 500 мл коммерчески доступных питательной среды с глютамином и фенола красного. Наливайте 150 мкл DF20 питательной среды в каждой из внутренней 16 скважин 24-multi ну блюдо. Налейте 1 мл физиологического раствора фосфатного буфера (PBS) [хлорид калия (200 мг/Л), Калия фосфат монофазных (200 мг/Л), хлорид натрия (8000 мг/Л) и калия фосфат двухфазный (2160 мг/Л)] остальные внешние скважин. Промыть крошечные мышцы куски 2 x в PBS. Разделите их на очень мелкие кусочки с помощью скальпеля и щипцы и Поместите кусочек (размер кончика лезвия скальпеля) в каждой внутренней-16 хорошо несколькими хорошо блюдо. Место несколько хорошо блюдо в инкубаторе, поддерживается на следующих условиях: 37 ° C, 21% O2и 5% CO2. Контролировать каждый день под инвертированным микроскопом скважин и добавьте 50 мкл DF20, если необходимо предотвратить клетки от высыхания.Примечание: После приблизительно 10 d, будет достаточно клетки, выросли из экспланта разрешить изоляции стволовых клеток. Протокол может быть приостановлена здесь. Когда видна гало клеток вокруг мышц эксплантах, выбросьте экспланта мышечной ткани. Отсоединить клетки с помощью 150 мкл раствора ЭДТА содержащих трипсина в каждой скважине: отбросить питательной среды, промойте клетки с 1 мл раствора PBS, отбросить PBS и добавить раствор трипсина для максимум 10 минут при 37 ° C. Добавить питательной среды остановить действие трипсина, урожай суспензию клеток, и, затем, центрифуга суспензию клеток на 200 x g в течение 10 минут при 37 ° C. Отменить супернатант и приостановить гранулы в сбалансированного солевого раствора. Передача суспензию клеток на градиент разрывными плотности 3 слоев (15%, 25% и 35%). Центрифуга трубка, содержащая суспензию клеток и разрывные плотность градиента решение на 1250 x g 20 мин при 25 ° C. Не используйте тормоз центрифуги. Наблюдать за клеток фракций различной плотности, которые будут отображаться между различными слоями разрывными плотность градиентного раствора после центрифугирования. Продолжить культуры с долей между 15 и 25%. Передача его в трубку и промойте его сбалансированного солевого раствора. Центрифуга суспензию клеток на 200 x g в течение 10 минут при 37 ° C. Выбросите супернатант. Приступайте к приостановке гранулы в 1 мл DF20. Заполнять клетки культуры колбу, с поверхностью 25 см2, с 6 мл DF20. Перевести клетки в колбу преднаполненных клетки культуры и культуры их в инкубаторе с соблюдением следующих условий: 37° C, 21% O2и 5% CO2.Примечание: Протокол может быть приостановлена здесь. Контролировать каждый день под инвертированным микроскопом клетки. При необходимости измените питательной среды (отбросить старые среднего и добавить 6 мл новой питательной среды). Определите сотовой слияния, наблюдая слои клеток в культуре блюда, с помощью оптического микроскопа в предопределенный масштаб. Оцените поверхность блюдо, которое занимают клетки. Работают на фиксированной микроскопического увеличения для каждого наблюдения иметь возможность оценивать слияния. Когда клетки занимают 85% поверхности блюдо, продолжите проход клеток. Когда клетки вырожденная, отсоедините их с помощью решения трипсина содержащие ЭДТА с тот же протокол, как описано в шаге 2.4. Затем центрифуга суспензию клеток на 200 x g в течение 10 минут при 37 ° C. Отменить супернатант и продолжите ресуспендирования клеток в 5 мл DF20. Поместите их в колбе культуры клеток 175 см2 заполнено автоматически с 25 мл DF20. Место колбу в инкубаторе с соблюдением следующих условий: 37° C, 21% O2и 5% CO2.Примечание: Протокол может быть приостановлена здесь. Контролировать каждый день под инвертированным микроскопом клетки. При необходимости измените среднего (отбросить старые среднего и добавьте новое средство по 30 мл). Когда клетки вырожденная, отсоедините их с помощью трипсина ЭДТА, как описано в шаге 2.4. Затем центрифуга суспензию клеток на 200 x g в течение 10 минут при 37 ° C. Отменить супернатант и приостановить клетки в 6 мл DF20. Место 1 мл суспензии клеток в шести 175 cm2 фляги, каждый заполнено автоматически с 25 мл DF20 и их культура при 37 ° C в инкубатор CO2 (с 21% O2 и 5% CO2). Контролировать каждый день под инвертированным микроскопом клетки. При необходимости измените среднего (отбросить старые среднего и добавить новое средство по 30 мл в каждом колбу). Когда клетки вырожденная, отсоедините их с помощью трипсина ЭДТА, как описано в пункте 2.5. Центрифуга для них 3 x 200 x g 10 минут при 37 ° C и удалить супернатант на каждом шагу. Подсчет количества ячеек с помощью Bürker, считая камеры и световой микроскоп. Подготовьте сотовых подвеска 10 миллионов клеток/мл среды, конкретных криоконсервирования. Глубокой заморозки терапевтических дозах 1 x 107 клеток в 1 мл среды криоконсервирования и хранить их в паровой фазе жидкого азота до их использования.Примечание: Протокол может быть приостановлена здесь. Корабль клетки во флаконе на сухой лед для конечного использования. 3. инъекции клеток Примечание: Два человека требуются для выполнения инъекции стволовых клеток. Теплый суспензию клеток постепенно до комнатной температуры. Аспирационная подвеска в шприц 2 мл. Степенный лошади путем инъекций Детомидина 10 мкг/кг в яремную Вену с 19 G подкожных игл. Подождите 5 минут, чтобы увидеть полный эффект седативных препаратов, который становится видимым по характерным позиции вниз головой лошади. Клип зоны 20 х 10 см2 над левой гортани региона лошади с клипер, как показано на рисунке 2. Затем примените хирургической скраб мыло полииодидов и алкоголя в подстриженные регион. Поместите гибкий стандарт видео эндоскоп через левую ноздрю лошади и выдвинуться к носоглотки. Отрегулируйте положение эндоскоп, пока не получили полное представление о arytenoid хрящей и надгортанник. Держите эндоскоп в этом положении во время процедуры и поверните экран видео эндоскоп к операторам. Подключите к нейростимулятор отрицательный электрод стимуляции/иглу. Поддерживать стерильной иглой. Соединить положительный электрод нейростимулятор электрода патч, который застрял в области обрезанный кожи. Подключите шприц, содержащего суспензию клеток к линии впрыска и заполнять трубку преследовать воздуха системы. Помните, объем системы и подготовки шприц с такой же объем стерильным физиологическим раствором. Если не знакомы с этой техникой, используйте преобразователь линейных УЗИ вылеченных 5-7 МГц для визуализации анатомических структур в регионе интереса. Используйте стерильные УЗИ муфты гель для повышения качества изображения. Визуализация гортани и судов, которые работают в регионе спинной гортани. Как только знаком с анатомией региона, ввести стимуляции/иглу к Дорсолатеральное аспект гортани. При приближении Дорсолатеральное аспект гортани, запустите нейростимулятор в стимуляции режиме 1 Гц с ток 2 мА. Осторожно двигаться иглы к позиции ПГН соблюдая эндоскопической представление на экране. Как только похищение движение левой arytenoid хряща виден на экране видео, уменьшите ток до тех пор, пока движение исчезает при сохранении иглы на месте. Определите идеальное положение иглы. Рассмотрим потеря мотор ответ на 0,5 мА как идеальное расстояние от нерва. Когда arytenoid хряща движения сохраняются на токах меньше 0,4 мА, не вводите клетки, как это может привести к инактивируемых инъекции. Когда потеря мотор ответ на 0,5 мА наблюдается, инъекционные суспензии клеток, содержащих 107 аутологичных стволовых клеток и промойте топливопровод солевой раствор готовят в шаге 3.6. Это будет внедрить остальные суспензии клеток, которые остались в трубки впрыска. После инъекции клеток выньте иглу и эндоскоп. Пусть лошади оправиться от седативных препаратов. Без дальнейшего лечения необходима для биопсии узла.