Otolog kök hücre yakınındaki at sol tekrarlayan gırtlak sinir sinir Stimülatörü güdümlü enjeksiyon

Etik kullanmak için komisyon of Liege Üniversitesi hayvanların çalışma protokolü onayladı. 1. Kas Microbiopsy Görsel muayene ve palpasyonla, triceps kas, yaklaşık orta hat noktası dirsek ve omuz noktası arasında uzun Başkanı tarafından örnek siteyi tanımlar. Küçük bir elektrik kesme makinesi ile yaklaşık2 2 x 2 cm bir bölge. Cerrahi fırçalayın için kırpılan alanın üzerine 1 dk polyiodide sıvı sabun ve alkol sıkıştırır oluşan uygulanır. Kirpik ve dezenfekte bölge merkezinde 25 G iğne ile subkutan 1 mL %2 lidokain çözeltisi enjekte. Antibakteriyel sabun ile El fırçalayın. Steril eldiven takmışım. Tek kullanımlık steril örtü steril bir yüzey üzerinde Biyopsi iğnesini ve trokar eklemenizi sağlar. Yarı otomatik 14 G Biyopsi iğnesini rakamlar 1b ve 1 cgösterildiği gibi bahar mekanizması çekerek kol. Onun mekanizma ile tanımak için Biyopsi iğnesini serbest bırakın. Silahlı Biyopsi iğnesini steril yüzey üzerine yerleştirin. Oluşan bir kanül ve Şekil 1biriçinde gösterildiği gibi bir obturator trokar hakkında bilgi edinin. Resim 1 : Biyopsisi iğne kümesi. Biyopsi iğnesi (bir) kanül ve onun obturator ve biyopsi oluşan küme iğne (üstten alta). Diğer panellerin Biyopsi iğnesini onun (b) tarafsız göstermek ve (c) pozisyon silahlı. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız. Trokar kanül ve obturator birleştirerek hazırlamak ve bir konumda saklayın. Trokar dik cilt eski düşüncesiz bölgesi ile tanıtmak. Trokar trokar ucu yaklaşık 1.5 cm nerede bir konuma ilerletmek derin kas içinde. Trokar çıkar, onun obturator üzerinden kanül ayırmak ve obturator steril yüzey üzerine yerleştirin. Silahlı Biyopsi iğnesini kanül aracılığıyla tanıtmak. İğne ve kas içine cilt kesi yoluyla kanül tanıtmak. İğne iğne ucu ortasında triceps kas kafa uzun nerede bir konuma ilerlemek. Biyopsi iğnesini yayın ve Biyopsi iğnesini kanül ile birlikte dışarı çekin. Biyopsi iğnesini kanül dışarı çekin. Kanül steril yüzeyde bırakın. Biyopsi iğnesini bahar tek elle çekerek ve diğer tutarak açın.Not: Örnek Biyopsi iğnesini ucunda görünür hale gelir. İkinci bir kişi sayesinde, örnek ortam içeren örnek tüp açın. 19 G Hipodermik İğne Biyopsi iğnesini küçük kas parçası kaldırmak için kullanın. Kas örnek örnekleme ortamda yerleştirin. Vida kapaklı tüp kapatın ve hafifçe eğimli örnek ortamda yüzer emin olmak için 2 x. Biyopsi iğnesini kol. Kabul kanül steril yüzey ve silahlı Biyopsi iğnesini ve kanül yenilemek. Silahlı iğne ve kanül daha önce açıklandığı gibi cilt kesi yoluyla tanıtmak. Yaklaşık 20 mg kas dokusunun örneklenir kadar 2-3 x örnek yordamı yineleyin. Örnekleme tüp kapatın. Yavaşça çevirmek tüp 2 x kas parçaları ile örnekleme orta karıştırmak için. 4-8 ° c arasında sabit bir ısıda laboratuvar örnekleri gemiNot: Laboratuvar sonra örnek işleyecektir. Protokol burada duraklatılmış. Yordamı iyi tolere edilir ve örnekleme tarafında ağrı değil görülmektedir. Kas ağrıları örnekleme sitesinde gözlenen olası olay uygun analjezik tedavi yönetmek. 2. tedavi hücre Not: Bu çalışmada kullanılan kök hücreler Ceusters vd tarafından açıklanan yöntemine göre hazırlanmıştır 7. kendi makalede ayrıca hücrelerin karakterizasyonu. Özel kültür ortam, DF20, ısı inaktive fetal Sığır serum, 5 mL penisilin (1000 IU/mL) % 20’si ekleyerek hazırlayarak başlayın-streptomisin (10.000 µg/mL) ve Amfoterisin B (250 µg/mL) için piyasada bulunan 500 mL şişe 2.5 mL Glutamin ve fenol red ile kültür orta. DF20 kültür ortamının 150 µL her bir 24-multi-da yemek iç 16 kuyu içine dökün. 1 mL fosfat tamponlu tuz (PBS) [potasyum klorür (200 mg/L), potasyum fosfat monophasic (200 mg/L), sodyum klorür (8000 mg/L) ve potasyum fosfat diphasic (2160 mg/L)] kalan dış kuyu dökün. Durulama küçük kas PBS 2 x adet. Bunları bir neşter ve forseps yardımıyla çok küçük parçalar halinde ayırın ve küçük bir parça (neşter bıçak ucu boyutunu) içinde de çok iyi yemek, her iç-16 yerleştirin. Aşağıdaki koşullar tutulan bir kuluçka çok iyi çanak yerleştirin: 37 ° C, % 21 O2ve %5 CO2. Kuyuları ters bir mikroskop altında her gün izlemek ve DF20 50 µL hücreleri kurumasını önlemek gerekirse ekleyin.Not: yaklaşık 10 d sonra kök hücre izolasyon izin vermek için explant yetiştirilen yeterince hücre olacak. Protokol burada duraklatılmış. Ne zaman bir hale hücre kas görünür olacağını explants, kas dokusu explant atın. Hücreleri her kuyuya EDTA içeren tripsin çözümünün 150 µL kullanarak bağlantısını kesin: kültür orta atmak, PBS 1 mL hücrelerle durulama, PBS atmak ve tripsin çözüm en fazla 10 dk 37 ° C’de ekleyin Kültür tripsin eylemi durdurmak, hücre süspansiyon hasat ve sonra hücre süspansiyon vasıl 200 x g 37 ° C’de 10 dakika santrifüj kapasitesi için orta Ekle Süpernatant atın ve Pelet dengeli tuz çözeltilerine askıya alma. Hücre süspansiyon kesintili yoğunluğu degradeyi 3 kat (% 15, % 25 ve % 35) üzerinde aktarın. Hücre süspansiyon ve kesintili yoğunluğu degrade çözüm 1,250 x g için 25 ° C’de 20 dk de içeren tüp santrifüj kapasitesi Santrifüj fren kullanmayın. Kesintili yoğunluk gradient çözüm Santrifüjü sonra farklı katmanları arasında görünür farklı yoğunlukları ile hücre kesirler gözlemlemek. Kültür 15 ve % 25 arasında kesir ile devam edin. Bir tüp aktarmak ve dengeli tuz solüsyonu ile yıkayın. Hücre süspansiyon vasıl 200 x g 37 ° C’de 10 dakika santrifüj kapasitesi Süpernatant atmak. 1 mL DF20 Pelet askıya ile devam edin. DF20 6 mL ile 25 cm2, yüzeyli bir hücre kültür şişesi prefill. Hücreleri doldurulmuş hücre kültür şişesi aktarmak ve onları bir kuluçka aşağıdaki koşullar ile kültür: 37° C, % 21 O2ve %5 CO2.Not: Protokol burada duraklatılmış. Hücreleri her gün ters bir mikroskop altında izlemek. Kültür orta gerekirse değiştirin (eski orta atmak ve yeni kültür orta 6 mL ekleyin). Hücresel kesiştiği yerde önceden tanımlanmış bir büyütme optik bir mikroskop kullanarak hücre katmanlarında kültür yemekleri gözlemleyerek belirlemek. Hücreler tarafından işgal çanak yüzeyi tahmin ediyoruz. Sabit bir mikroskobik büyütmede kesiştiği yerde değerlendirmek her gözlem için çalışıyorum. Hücreleri çanak yüzeyinin % 85’i işgal, hücreleri bir geçit ile devam. Hücreleri konfluent olduğunuzda, EDTA içeren tripsin çözümünü 2.4 adımda anlatıldığı gibi ile aynı iletişim kuralını kullanarak ayırabilirsiniz. Sonra hücre süspansiyon vasıl 200 x g 37 ° C’de 10 dakika santrifüj kapasitesi Süpernatant atın ve 5 mL DF20 de hücrelerde resuspension devam etmek. 175 cm2 DF20 25 mL ile doldurulmuş bir hücre kültür şişesi içine koyun. Aşağıdaki koşullar ile bir kuluçka şişeye koyun: 37° C, % 21 O2ve %5 CO2.Not: Protokol burada duraklatılmış. Hücreleri her gün ters bir mikroskop altında izlemek. Orta gerekirse değiştirin (eski orta atmak ve yeni orta 30 mL ekleyin). Hücreleri konfluent olduğunda tripsin-EDTA 2.4. adımda açıklandığı gibi kullanarak ayırabilirsiniz. Sonra hücre süspansiyon vasıl 200 x g 37 ° C’de 10 dakika santrifüj kapasitesi Süpernatant atmak ve DF20 6 mL hücrelerde askıya alma. Yer 1 mL altı 175 cm2 şişe içine hücre süspansiyon, her DF20 25 mL ile doldurulmuş ve onları bir CO2 kuluçka ( O2 ve %5 CO2ile) 37 ° C’de kültür. Hücreleri her gün ters bir mikroskop altında izlemek. Orta gerekirse değiştirin (eski orta atmak ve yeni orta 30 mL her şişeye ekleyin). Hücreleri konfluent olduğunda tripsin-EDTA 2.5. adımda açıklandığı gibi kullanarak ayırabilirsiniz. Onları santrifüj kapasitesi 3 x 200 x g 10 dk 37 ° C ve atma süpernatant her adımda için de. Bir Bürker sayım odası ve ışık mikroskop yardımıyla hücreleri saymak. 10 milyon hücre/mL belirli dondurma orta hücresel bir süspansiyon hazırlamak. Tedavi edici dozlarda dondurma orta 1 mL 1 x 107 hücrelerinin kuzine ve bunların kullanımı kadar sıvı azot buharı aşamasında depolayabilirsiniz.Not: Protokol burada duraklatılmış. Şişeyi son kullanım için kuru buzda hücrelerde gemi. 3. enjeksiyon hücrelerin Not: Enjeksiyon kök hücrelerin gerçekleştirmek için iki kişi gerekir. Hücre süspansiyon giderek için oda sıcaklığında ısıtın. Süspansiyon 2 mL şırınga Aspire edin. At detomidine 10 µg/kg juguler ven 19 G Hipodermik iğne ile enjekte edilerek sakinleştir. At karakteristik baş aşağı konumunu tarafından görünür hale gelir sedasyon tam etkisini görmek için 5 dakika bekleyin. Şekil 2′ de gösterildiği gibi bir kesme makinesi ile at sol gırtlak bölge üzerinde bir bölge 20 x 10 cm2 küçük. Daha sonra bir cerrahi bodur polyiodide sabun ve alkol kısaltıldı bölgesine uygulayın. Esnek bir standart video endoskop at sol burun yoluyla yerleştirin ve nazofarinksi doğru ilerlemek. Arytenoid kıkırdak ve gırtlak kapağını tam bir görünümünü elde edene kadar endoskop konumunu ayarlayın. Endoskop işlem sırasında bu konumda tutun ve işleçleri doğru video endoskop ekran dönüş. Stimülasyon/enjeksiyon iğne sinir Stimülatörü’nın negatif elektrot için bağlayın. İğne Steril koşullar korumak. Sinir Stimülatörü pozitif elektrot kirpik cilt bölgeye sıkışmış bir elektrot yama bağlayın. Enjeksiyon satırına hücre süspansiyon içeren şırınga bağlanmak ve hava sisteminin kovalamak için tüp prefill. Sistem hacmi hatırlıyorum ve bir şırınga steril serum fizyolojik çözüm aynı hacmi ile hazırlayın. Tanıdık değil, bu teknik ile bir dezenfekte 5-7 MHz lineer Ultrason çevirici ilgi bölgede anatomik yapıları görselleştirmek için kullanın. Steril bir ultrason jeli kaplin görüntü kalitesini artırmak için kullanın. Gırtlak ve gırtlak dorsal bölgede çalışan gemiler görselleştirin. Bölge anatomisi ile tanıdık bir kez stimülasyon/enjeksiyon iğne gırtlak dorsolateral yönünü doğru tanıtmak. Gırtlak dorsolateral yönünü yaklaşırken, sinir Stimülatörü bir akım 2 ile 1 Hz stimülasyon modda başlatmak anne. Yavaşça iğneyi endoskopik görünüm üstünde belgili tanımlık perde kesilmediğini gözleyerek tekrarlayan gırtlak sinir konumunu doğru hareket ettirin. Sol arytenoid kıkırdak kaçırma hareketini video ekranda görünür olduğunda, hareketin yerde iğne tutarken kaybolana kadar geçerli azaltmak. İğne ideal konumunu tanımlayın. 0.5, motor yanıt kaybı dikkate sinir ideal mesafe olarak anne. Ne zaman arytenoid kıkırdak hareketleri kalıcı akımları 0,4 düşük, mA,-değil enjekte hücreleri, bu intraneuronal iğne neden olabileceğinden. MA görülmektedir, 0.5, motor yanıt kaybı 107 otolog kök hücre içeren hücre süspansiyon enjekte ve enjeksiyon satır hazırlanan tuzlu çözüm ile flush 3.6. adımda. Bu enjeksiyon tüpte kaldı hücre süspansiyon kalan enjekte edecek. Hücreleri enjeksiyon sonra iğne ve endoskop al. Sedasyon kurtarma atı Sal. Daha fazla tedavi biyopsi site için gereklidir.